基于AAV递送CRISPR gRNA实现造血干细胞原位基因编辑治疗血液遗传病

　　本研究通过腺相关病毒（AAV）递送CRISPR引导RNA（gRNA），在携带Cas9系统的转基因小鼠中实现了造血干细胞（HSCs）的高效原位基因编辑。研究团队系统优化了载体设计（如采用自互补型scAAV）和gRNA与Cas9的比例，显著提升了基因编辑效率，同时保持了HSCs的多向分化能力和移植潜能。在镰状细胞病（SCD）模型小鼠中，该方法成功诱导了治疗性胎儿血红蛋白（HbF）的表达。该技术为单基因血液病的体内治疗提供了创新性平台。

　　

在生命科学与医学研究领域，造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSCs）一直被视为治疗血液系统遗传疾病的理想靶点。它们具有自我更新、多向分化并能够在受体体内稳定植入的特性，这为通过基因矫正治疗单基因遗传病（如镰状细胞病、地中海贫血等）提供了可能。然而，传统的基因治疗方法通常需要将HSCs从患者体内取出，在体外进行基因操作后再回输，整个过程复杂、成本高昂且存在细胞损伤、污染和安全风险。因此，能否直接在体内、在原位对HSCs进行高效、安全的基因编辑，成为了该领域一个亟待突破的关键问题。

为了应对这一挑战，来自Joslin糖尿病中心的研究团队在《Blood Advances》上发表了一项突破性研究。他们开发了一种创新的技术策略：利用腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）作为载体，直接将CRISPR基因编辑系统中的引导RNA（guide RNA, gRNA）递送到体内的造血干细胞中，从而实现原位（in situ）基因编辑。这种方法旨在规避体外操作的诸多弊端，充分利用机体自身的HSCs资源，为开发更安全、高效的基因治疗手段铺平道路。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术方法：研究首先利用了转基因小鼠模型（Ai9;SpCas9-EGFP），该模型体内稳定表达SpCas9蛋白和一种可被CRISPR编辑激活的Lox-STOP-Lox (LSL)-tdTomato红色荧光报告基因；通过系统性注射不同血清型和设计（包括自互补scAAV与单链AAV）的AAV载体，这些载体包装了针对报告基因STOP盒上下游的gRNA；通过流式细胞术等技术定量分析tdTomato⁺细胞的比例以评估编辑效率；并通过骨髓移植实验评估编辑后HSCs的长期多系重建（multilineage reconstitution）能力与移植（engraftment）潜能；最后，在一个表达SpCas9的镰状细胞病（Sickle Cell Disease, SCD）小鼠模型中，通过双AAV载体递送靶向HBG基因的gRNA，并采用高效液相色谱（HPLC）等方法检测治疗性胎儿血红蛋白（HbF）的诱导水平。

优化AAV递送条件以提升原位HSC编辑效率

研究团队通过在不同条件下给转基因小鼠注射携带gRNA的AAV病毒，发现自互补型AAV（scAAV）相较于传统单链AAV能更高效地递送gRNA，并诱导更高比例的tdTomato⁺细胞，证明其是更优的递送载体。同时，提高注射病毒中gRNA与细胞内固有Cas9蛋白的比例（即提高感染复数MOI），也被证实是显著提升基因编辑效率的关键参数。

经编辑的HSCs保持其关键干细胞特性

一个至关重要的发现是，经过scAAV-gRNA原位编辑后，能够表达tdTomato的HSCs（即被成功编辑的细胞）在移植到受体小鼠体内后，依然能够长期、稳定地重建造血系统，并分化为髓系、B细胞、T细胞等多个血液细胞谱系。这表明AAV-CRISPR原位编辑过程并未损害HSCs的核心功能——自我更新和多向分化潜能。

在疾病模型中验证治疗潜力：诱导胎儿血红蛋白

为了展示该技术的治疗应用前景，研究在一个镰状细胞病（SCD）模型小鼠中进行了概念验证。他们通过双AAV载体分别递送两个靶向人HBG基因启动子的gRNA，成功在体内编辑了HSCs的基因组，并高效诱导了治疗性胎儿血红蛋白（HbF）的表达。HbF的产生是治疗SCD和β-地中海贫血的重要策略，该结果强有力地证明了此原位编辑平台用于治疗单基因血液疾病的巨大潜力。

综上所述，本研究成功地建立了一个灵敏且适应性强的技术平台，能够利用AAV递送CRISPR gRNA在体内对造血干细胞进行高效、精准的原位基因编辑。其核心结论在于：第一，自互补AAV（scAAV）和高gRNA:Cas9比例是实现高效率编辑的关键因素；第二，该编辑过程不会影响HSCs的多系分化输出能力和移植潜能，确保了治疗的安全性；第三，这项技术在SCD疾病模型中有效诱导了治疗性HbF的产生，证明了其强大的治疗应用价值。

在讨论中，作者强调了这种“体内基因编辑”策略相较于传统体外基因治疗的巨大优势，包括简化治疗流程、降低成本和避免体外培养对细胞功能的负面影响。尽管目前的研究是在预先表达Cas9的转基因模型中完成的，但该工作为最终实现“全体内”（all-in-one in vivo）基因编辑疗法奠定了坚实的基础。未来，通过将Cas9与gRNA共同递送或使用其他可体内递送的编辑器（如碱基编辑器），有望开发出一次注射即可完成治疗的革命性方案，最终造福广大遗传性血液病患者。