综述：化学蛋白质组学的新兴趋势：绘制蛋白质-代谢物相互作用图谱

　　本综述系统梳理了化学蛋白质组学技术在解析蛋白质-代谢物相互作用（PMI）领域的最新进展，重点介绍了基于衍生化（如光亲和探针）和非衍生化（如DARTS、LiP-MS、TPP、TRAP）两大策略的技术原理与应用，展现了该技术在揭示代谢调控网络、疾病机制及药物靶点发现方面的巨大潜力。

　　

引言

代谢物不仅是细胞代谢的基本反应物和产物，更是作为重要的信号分子通过变构调节、直接酶促反应、驱动翻译后修饰（PTMs）以及表观遗传调控等方式精确控制蛋白质功能。蛋白质-代谢物相互作用（PMI）因此成为调控细胞能量稳态、信号转导和基因表达的核心环节。然而，PMI的瞬时性和动态特性为其检测带来了巨大挑战。化学蛋白质组学作为一种强大且通用的策略，凭借其蛋白质组水平的分辨能力，已成为捕获和表征PMI的关键技术。这些方法主要可分为两类：基于衍生化的方法利用化学修饰的探针富集蛋白质靶标；而非衍生化方法则借助高灵敏度的蛋白质组学分析，检测代谢物结合后蛋白质理化特性的变化。

基于衍生化的化学蛋白质组学策略

该类方法采用特殊设计的探针来捕获共价或非共价PMI，靶标通过生物正交手柄或亲和标签进行富集，并通过质谱（MS）进行鉴定。

共价探针的应用

某些具有亲电基团的代谢物能共价修饰蛋白质上的亲核氨基酸残基。基于此，研究者设计了多种探针。例如，基于衣康酸能共价修饰蛋白质的特性，Wang课题组设计了带有炔柄的ITalk探针。O‘Neill团队利用该探针发现衣康酸及其衍生物靶向JAK1，抑制巨噬细胞替代性激活，为治疗哮喘等2型免疫驱动疾病提供了潜在策略。Wang课题组还设计了C3A探针，其用酰胺键替代酯键连接不饱和羧酸与丙炔基，避免了细菌特异性水解酶对酯键的切割。该探针揭示了衣康酸在鼠伤寒沙门氏菌中结合异柠檬酸裂解酶并抑制其活性和稳定性，从而发挥抗菌作用。该探针的进一步应用还在三种病原体中全局性绘制了衣康酸修饰靶点，发现PMI主要发生在de novo嘌呤合成通路中，使其成为新型抗菌药物的潜在靶点。

代谢标记探针也被用于研究共价PMI。例如，YnLac是一个在乳酸甲基末端连接炔基的类似物，它能掺入细胞蛋白中，从而鉴定出PARP1是乳酸的修饰靶点，并进一步观察到乳酸衍生的修饰调控了PARP1的ADP-核糖基化活性。

鉴于许多共价PMI通常修饰半胱氨酸和赖氨酸等活性残基，竞争性分析也被用于PMI作图以规避代谢物衍生化。在此策略中，来自代谢物预处理和未处理样品的蛋白质会用残基反应性探针进行共价修饰，靶标富集的差异揭示了代谢物反应性位点。例如，Meier课题组采用碘乙酰胺-炔烃（IA-alkyne）探针竞争性分析延胡索酸（一种可共价修饰半胱氨酸硫醇的癌代谢物）的靶标。这项工作在遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌中发现了受延胡索酸 engagement 影响的功能相关性半胱氨酸位点，揭示了由生物活性代谢物驱动的遗传性癌症机制。值得注意的是，该策略的一个局限性是，虽然它能有效精确定位对代谢物 engagement 敏感的残基，但不能直接确定这些位点是代表主要结合位置还是通过变构效应影响的区域。

光亲和探针的应用

与共价PMI不同，一些代谢物通过亲和结合蛋白质来调节生物学功能。为了捕获这种可能瞬时且不稳定的PMI，光亲和探针应运而生。这些探针包含光反应基团（如芳基叠氮化物、芳基酮或二氮杂环丙烷），在紫外线照射下能与附近蛋白质形成共价键。光亲和探针已被广泛用于捕获脂质（如多不饱和脂肪酸、胆固醇、磷脂）、糖酵解代谢物（如果糖-1,6-二磷酸 FBP）、酶辅因子（如维生素B₁₂）和胆汁酸代谢物的结合靶点。

胆汁酸衍生化光亲和探针的最新进展使得鉴定微生物代谢物在宿主细胞和微生物群中的直接靶标成为可能。在此基础上，Hang课题组设计了一种用于次级胆汁酸石胆酸（LCA）的光亲和探针，并利用它阐明了其在E. faecium中的PMI。随后通过与Shen课题组的合作，他们应用该探针鉴定出BapR，一种在C. difficile中的新型LCA感应转录因子，它通过基因调控介导代谢适应，揭示了肠道微生物群-病原体相互作用的机制见解。在最近的一项研究中，Lin课题组通过设计一种包含二氮杂环丙烷基团（用于光亲和捕获PMI）和炔柄（用于富集）的多功能探针，研究了LCA的抗衰老机制。化学蛋白质组学分析显示，LCA并不直接结合SIRT1。相反，Pull-down和基因敲除实验确定TULP3为主要靶点，LCA与TULP3结合变构激活SIRT1。TULP3–SIRT1复合物使v-ATP酶的V1E1亚基去乙酰化，抑制其活性。这种抑制激活了AMPK通路，减少了卡路里摄入并延长了寿命。这些发现揭示了一种新的抗衰老机制，并拓宽了我们对胆汁酸代谢物在人类中多样化作用的理解。

非衍生化的化学蛋白质组学策略

基于衍生化的方法虽然为PMI研究提供了宝贵见解，但需要对目标代谢物进行化学修饰，这可能改变代谢物的天然理化性质，从而偏向相互作用图谱并导致捕获有偏差的PMI。这些局限性推动了非衍生化化学蛋白质组学方法的发展，这些方法在不改变代谢物本身的情况下，在蛋白质组水平识别代谢物结合靶蛋白。本节介绍此类非衍生化策略，它们通过监测代谢物结合后蛋白酶抗性、热稳定性及蛋白质可及性的变化来检测PMI。

基于蛋白酶抗性的方法

早期对基因启动子的研究表明，DNA结合位点在被转录因子结合后表现出对核酸酶降解的抗性。这一观察启发了药物结合可能类似地赋予靶蛋白蛋白酶抗性的假设。为此开发的第一个方法是药物亲和反应靶标稳定性（DARTS）。在DARTS中，配体与细胞裂解液孵育，然后用非特异性蛋白酶处理。随后通过凝胶电泳或液相色谱-质谱（LC-MS）评估蛋白质降解情况，将表现出显著稳定性变化的蛋白质鉴定为潜在靶标。最近，Tang课题组应用DARTS证明苹果酸盐直接结合免疫球蛋白结合蛋白（BiP），这是苹果酸盐在巨噬细胞中抗炎作用的关键介质。

另一个广泛使用的基于蛋白酶抗性的方法是有限蛋白酶解-质谱（LiP-MS），它提供了配体诱导的构象变化和结合口袋的详细见解。该方法包括用非特异性蛋白酶对蛋白质样品进行部分消化，然后用胰蛋白酶进行二次消化。Picotti课题组使用LiP-MS在E. coli中识别了1447个先前未知的PMI及其相关结合位点。LiP-MS此后被应用于研究肿瘤微环境中的PMI。He课题组使用该技术发现嘌呤代谢物肌苷在肿瘤细胞中结合UBA6并抑制其活性。这种PMI使肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤敏感，从而增强肿瘤免疫原性并产生免疫活性微环境。LiP-MS还被用于阐明精氨酸的结合靶点，并发现了三个对精氨酸依赖性T细胞存活至关重要的转录调节因子。

此外，Ye课题组最近开发了肽中心局部稳定性分析（PELSA），它通过使用高酶底物比进行破坏性胰蛋白酶消化来放大配体诱导的蛋白质稳定性变化。PELSA对传统药物靶点发现和低亲和力PMI均有效，如其能够检测到弱PMI，如叶酸-DHFR（K_a = 98 ± 20 mM）和亮氨酸-LARS1（K_d = 96.1 ± 37.7 μM）。将PELSA应用于α-酮戊二酸（α-KG）及其结构相关的癌代谢物R-2-羟基戊二酸（R2HG）揭示了不同的结合偏好，丙酮酸羧化酶对R2HG显示出更高的亲和力。鉴于丙酮酸羧化酶是三羧酸（TCA）循环回补反应的关键酶，这些发现为IDH2突变癌症中R2HG积累至高水平所导致的TCA循环失调提供了机制见解。

基于热稳定性的方法

细胞热位移分析（CETSA）和热蛋白质组分析（TPP）被广泛用于监测小分子结合后蛋白质热稳定性的变化。TPP整合温度梯度和质谱以生成蛋白质熔解曲线，能够对配体 engagement 诱导的热稳定性变化进行高通量的全蛋白质组分析。Geng课题组最近将TPP应用于PMI研究，鉴定了果糖-1,6-二磷酸（FBP）结合蛋白，揭示FBP作为磷酸供体通过组氨酸磷酸化激活磷酸甘油酸变位酶1（PGAM1），从而促进糖酵解和肿瘤增殖。基于这一发现，他们设计了FBP类似物1-DMeFBP，它能破坏磷酸转移并抑制PGAM1活性，为靶向癌症代谢提供了潜在治疗策略。更广泛地说，TPP已越来越多地应用于研究内源性配体，如金属离子和 dinucleotide，证明了其作为PMI识别和获取代谢物作用机制见解的通用方法的实用性。

为了同时评估热稳定性和结合亲和力，开发了二维TPP（2D-TPP）方法。该方法结合多个配体浓度和温度梯度，提高了PMI检测的分辨率。例如，Savitski课题组应用2D-TPP，使用5个配体浓度和10个温度来表征Jurkat细胞裂解液中ATP介导的PMI。他们的研究揭示了ATP的动态作用——在低浓度时作为底物，在高浓度时作为蛋白质增溶剂，凸显了2D-TPP在阐明多功能代谢物方面的 versatility。

基于蛋白质可及性的方法

传统的基于稳定性的方法在研究具有特殊结构或功能特征（如极端耐热性、热不稳定性或对水解酶不敏感）的蛋白质时存在局限。为了解决这些挑战，我们课题组开发了靶标响应可及性分析（TRAP），这是一种互补的靶点发现方法，通过同位素编码二甲基化进行赖氨酸可及性分析，来绘制配体结合后全蛋白质组的可及性变化。与DARTS或TPP等基于稳定性的方法不同，TRAP能在残基水平精确定位配体结合区域，从而能够有效分析蛋白酶解或热稳定的蛋白质。

将TRAP应用于癌细胞，我们系统分析了十种关键糖酵解代谢物的PMI，识别出2487个相互作用，涉及代谢酶、转录调节因子和翻译后修饰蛋白。机制研究揭示：(i) 糖酵解代谢物以组成依赖性方式协同调节PKM2活性；(ii) 乳酸 engagement TRIM28，可能促进NLRC3抑制和PI3K-AKT-mTOR通路激活；(iii) 丙酮酸减弱曲古抑菌素A诱导的组蛋白乙酰化，保护癌细胞免于凋亡。这些结果确立了TRAP作为一个强大的平台，用于揭示PMI驱动的调控机制和识别癌症中的代谢脆弱性。

为了扩展基于蛋白质可及性的靶点识别工具箱，几种化学标记已被用于赖氨酸标记，并显示出PMI发现的潜力。例如，通过逆检测进行反应性氨基酸分析（RAPID）使用膜通透性邻苯二甲醛（OPA）探针标记活细胞中的赖氨酸残基，通过监测配体诱导的可及性变化实现药物靶点发现。其他试剂，如O-氰基苯甲醛和阳离子吡啶鎓活化酯，可以分析赖氨酸可及性，但尚未应用于药物靶点发现或PMI作图。连同靶向其他氨基酸的标记试剂，这些化学标记策略通过可及性分析在PMI检测方面具有强大潜力，并可能 substantially 拓宽代谢物靶点识别的范围。

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多种化学蛋白质组学技术的比较概述

基于最近的方法学进展，我们比较了当前化学蛋白质组学技术的优势与局限。基于衍生化的方法通过代谢物衍生化探针的富集来捕获PMI，允许直接相互作用检测和低丰度靶标的识别。然而，化学修饰可能改变代谢物性质并产生假阳性，通常通过内源性代谢物的竞争性对照来缓解。光亲和探针特别适用于研究非共价和瞬时相互作用，但需要紫外线照射，这可能引起非特异性交联。非衍生化方法，如LiP-MS、TPP和TRAP，提供了在更接近天然状态下研究PMI的替代方案，无需化学修饰。这些方法检测结合诱导的蛋白质特性变化，例如构象、热稳定性或表面可及性。它们的主要优势包括能够研究内源性代谢物和检测变构效应。然而，它们可能无法直接区分直接结合与间接效应，并且通常需要代谢物在较高浓度下孵育，这可能导致非生理性结合。

未来展望

尽管化学蛋白质组学取得了显著进展，但PMI的全面作图仍受三个相互关联的挑战所阻碍：(i) 跨组织、细胞和亚细胞区室实现空间分辨率；(ii) 计算能力在解读复杂多维数据集方面的不足；(iii) 以足够灵敏度检测低丰度相互作用。

为了解决空间分辨率差距，最近的进展现在能够跨生物尺度进行PMI分析。组织-TPP测量了小鼠多个器官中蛋白质的热稳定性。单细胞蛋白质组学方法，如scMS，可以分析单个细胞中的蛋白质表达和 PTMs，为将来研究细胞异质性中的PMI铺平了道路。亚细胞器分离与化学蛋白质组学相结合，能够研究区室化代谢物（如线粒体、细胞核）的PMI。这些空间分辨技术将揭示PMI在特定细胞类型和区室中的背景特异性作用。

在计算方面，人工智能（AI）和机器学习（ML）算法正在被开发用于从复杂的化学蛋白质组学数据中提取有意义的见解。这些工具可以预测PMI、识别结合位点、并将代谢物与生物学通路联系起来。将化学蛋白质组学数据与其他组学数据（如转录组学、表观基因组学）整合的多组学方法将提供对代谢调控网络的更全面理解。此外，开发用于PMI数据标准化、共享和可视化的数据库和资源将促进合作并加速发现。

最后，提高检测灵敏度对于发现低丰度代谢物及其相互作用至关重要。MS仪器的进步，如具有更高灵敏度和更快扫描速度的 orbitrap 质量分析器，将能够检测更低的丰度蛋白质和代谢物。新的样品制备和富集策略，如使用金属有机框架（MOFs）或亲和材料，可以进一步提高检测限。通过解决这些挑战，化学蛋白质组学将继续改变我们对PMI在健康和疾病中作用的理解。

Declaration of competing interest

作者声明不存在任何可能影响本工作报告的已知竞争性经济利益或个人关系。

Acknowledgements

本研究得到了国家自然科学基金、江苏省自然科学基金、中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室项目、国家重点研发计划、海外高层次人才引进项目等的支持。