局部构象约束的二甲苯环化SOCS3模拟肽的开发及其对JAK2信号通路的靶向抑制研究

　　本研究针对细胞因子信号通路关键负调控因子SOCS3蛋白模拟肽开发难题，通过区域选择性硫醚环化策略构建了四种新型单环KIRCONG chim PEG类似物。研究发现thio-monoright PEG1类似物对JAK2催化结构域表现出最高亲和力（KD～50 μM），并能有效抑制JAK2介导的磷酸化。结合圆二色谱和元动力学模拟证实环化类似物具有增强的结构有序性和分子内氢键网络。该研究为开发靶向JAK-STAT通路的新型肽类 therapeutics提供了重要理论依据。

　　

在细胞因子信号传导的精密调控网络中，Suppressor of Cytokine Signaling 3（SOCS3）蛋白扮演着至关重要的"刹车"角色。作为JAK-STAT信号通路的关键负调控因子，SOCS3通过双重机制抑制过度免疫反应：一方面直接结合细胞因子受体阻断STAT蛋白的激活，另一方面招募E3泛素连接酶复合物促进信号分子的降解。然而，SOCS3的表达失调与多种重大疾病密切相关——从慢性炎症性疾病、代谢综合征到肿瘤发生发展，特别是在非小细胞肺癌等恶性肿瘤中，SOCS3的甲基化沉默会导致STAT3信号的持续激活，促进肿瘤血管生成和细胞增殖。

尽管靶向JAK-STAT通路的小分子抑制剂（如tofacitinib、baricitinib等）已在临床应用于类风湿关节炎等自身免疫疾病，但这些抑制剂存在显著局限性：JAK2抑制剂可能影响造血功能，而STAT3抑制剂尚处于临床前研究阶段。相比之下，模拟天然调控机制的SOCS3蛋白模拟肽具有更高的靶标特异性，能够实现精准干预而减少副作用。然而，肽类 therapeutics的开发面临重大挑战：线性肽易被蛋白酶降解、构象灵活性过高导致结合亲和力不足，以及溶解性差等问题。

先前研究开发的线性肽KIRCONG chim虽显示出对JAK2催化结构域的高亲和力，但缺乏构象刚性，且水溶性较差。虽然通过引入PEG修饰（KIRCONG chim PEG）改善了溶解性，并利用PLGA纳米颗粒递送系统在三阴性乳腺癌模型中证明了其抑制STAT3磷酸化的能力，但仍需进一步优化其构象稳定性。令人意外的是，早期尝试通过碳氢化合物、二硫键和内酰胺大环化策略引入结构约束反而降低了JAK2结合亲和力，尽管提高了血清中的蛋白酶抗性。

在这项发表于《European Journal of Medicinal Chemistry》的研究中，意大利那不勒斯费德里科二世大学药学院的Daniela Marasco教授团队另辟蹊径，采用局部构象约束策略，设计了四种新型单环类似物。研究人员巧妙地运用区域选择性硫醚环化技术，分别对KIR（激酶抑制区）或CONG（延伸SH2子结构域）区域进行环化约束，创建了"thio-monoleft"和"thio-monoright"两类化合物。同时，通过引入不同数量的PEG单元（PEG₁或PEG₂）来平衡溶解性与柔性，旨在解决先前化合物溶解度不足的关键问题。

研究团队综合运用了固相肽合成与溶液相硫醇介导连接的组合策略，通过CLIPS（Chemical Linkage of Peptides onto Scaffolds）方法实现单环化构建。采用微尺度热泳动技术精确测定化合物与JAK2催化结构域的亲和力，并通过LC-MS磷酸化抑制实验评估其对JAK2激酶活性的抑制效果。圆二色谱分析揭示了化合物的二级结构特征，而元动力学模拟和密度泛函理论计算则从原子层面阐明了分子内氢键网络和溶剂可及表面积特性。荧光光谱技术用于考察化合物的聚集行为，自然键轨道和第二阶微扰理论分析则量化了分子内相互作用的能量贡献。

2.1. PEG硫代单环KIRCONG chim PEG类似物的设计

研究人员设计了四种KIRCONG chim PEG的新型局部约束类似物，分别通过溴代二甲烯衍生物环化KIR片段（"monoleft"化合物）或CONG区域（"monoright"类似物）。其中两种保留单个PEG单元（PEG₁），另两种含有两个PEG部分（PEG₂），旨在增强柔性和水溶性。通过在不同位置引入半胱氨酸残基，实现了选择性硫醇-溴化物连接，最终获得thio-monoleft PEG₁、thio-monoright PEG₁、thio-monoleft PEG₂和thio-monoright PEG₂四种目标化合物。所有化合物均显示较低合成产率，反映了合成复杂环肽与非氨基酸部分的固有挑战。

2.2. 二甲烯SOCS3模拟肽与JAK2催化结构域的亲和力

微尺度热泳动分析显示，thio-monoright PEG₂由于极差的水溶性无法进行可靠测定。其余三种化合物均呈现剂量依赖的MST信号，但亲和力均低于线性KIRCONG PEG（K_D～40 μM）。thio-monoleft PEG₁（K_D～100 μM）的亲和力比thio-monoright PEG₁（K_D～50 μM）低2倍，表明KIR片段的环化导致亲和力下降。thio-monoleft PEG₂由于溶解度限制未能达到信号饱和。荧光光谱分析证实thio-monoright PEG₂存在浓度依赖的荧光猝灭，表明其通过π-π堆积发生分子间聚集。

2.3. 二甲烯SOCS3模拟肽对JAK2激酶活性的抑制

基于亲和力结果，研究人员选择两种PEG₁变体进行JAK2激酶抑制实验。thio-monoright PEG₁在最低测试浓度（4 μM）下即可使磷酸化Srctide面积减少约50%，在25 μM时急剧下降至3%，在100 μM时进一步降至1.5%，显示出强烈的剂量效应关系。thio-monoleft PEG₁需要更高浓度（50 μM）才能观察到显著抑制，这与其较高的K_D值和较低的溶解度一致。实验结果与MST数据高度吻合，确认thio-monoright PEG₁具有最优的JAK2抑制活性。

2.4. 硫代单环类似物的圆二色谱构象研究

圆二色谱分析显示，在0% TFE条件下，PEG₁化合物的光谱与线性KIRCONG chim PEG明显不同，在222 nm处出现显著最小值，表明存在一定β-折叠结构贡献，而线性对应物主要呈现无规卷曲状态。thio-monoleft PEG₂的光谱更类似于线性类似物。所有化合物在50% TFE条件下均显示向更高螺旋含量的构象转变。谱图去卷积结果进一步证实了这些观察（表S2）。化合物的低水溶性阻碍了详细的NMR结构表征。

2.5. 二甲烯SOCS3模拟肽的计算研究

多尺度计算研究表明，单环类似物相比线性KIRCONG chim PEG具有减少的灵活性和更强的分子内氢键。自然键轨道和第二阶微扰理论分析显示，thio-monocyclic类似物的氢键数量和强度均高于线性肽，其中thio-monoright PEG₁具有最多的氢键数量（143个）和最高的总稳定化能（595.7 kcal/mol）。溶剂可及表面积计算表明，所有单环肽的疏水SASA百分比均高于KIRCONG（51.5%），thio-monoleft PEG₁、thio-monoright PEG₁、thio-monoleft PEG₂和thio-monoright PEG₂分别为69.4%、67.6%、65.1%和69.3%。单环肽的延伸结构导致总SASA值更大，而PEG单元的引入并未相应增加水溶性，特别是thio-monoright PEG₂由于其环状区域含有更多疏水部分（包括二甲烯部分），显示出最高的疏水表面暴露，这解释了其极差的水溶性。

本研究成功设计并评估了四种新型SOCS3拟肽类似物，通过区域选择性硫醚环化在KIR或CONG片段引入局部构象约束。thio-monoright PEG₁表现出最优异的综合性能：对JAK2催化结构域具有最高亲和力（K_D～50 μM），能有效抑制JAK2激酶活性，并在低微摩尔浓度下近乎完全抑制底物磷酸化。构象分析和计算模拟表明，其卓越性能源于增强的结构有序性和强大的分子内氢键网络。

研究揭示了环化位置和PEG单元数量对化合物性质的深刻影响：CONG区域的环化（monoright）比KIR区域的环化（monoleft）更有利于保持生物活性；增加PEG化程度（PEG₂）并未改善溶解性，反而因引入过度柔性和疏水表面暴露导致聚集倾向增加，损害了靶标结合能力。这些发现凸显了在SOCS3模拟肽理性设计中平衡刚性、柔性和疏水暴露的精细艺术。

该研究的重要意义在于：首先，证实了局部构象约束策略在优化肽类 therapeutics中的价值，thio-monoright PEG₁代表了具有改善生物活性的构象稳定型SOCS3模拟肽；其次，通过综合实验与计算方法的结合，为理解结构-活性关系提供了原子层面的见解；最后，为开发靶向JAK-STAT通路的新型治疗剂奠定了坚实基础，特别是在肿瘤免疫治疗和炎症性疾病领域具有广阔应用前景。