基于干血斑非靶向代谢组学的苯丙酮尿症代谢特征解析与提取方法优化研究

　　本研究针对苯丙酮尿症（PKU）代谢通路系统性紊乱机制不明确的问题，开发了一种基于干血斑（DBS）的非靶向代谢组学提取方案。通过对比9种溶剂与提取方法的组合，最终确立4℃过夜温和振荡结合乙腈/水（80:20）溶剂与氮吹浓缩步骤为最优方案，可提取2-6倍更多代谢物并显著提升氨基酸类化合物回收率。应用该方案成功区分PKU患者与健康人群的代谢谱，发现苯丙氨酸浓度梯度与多种氨基酸代谢通路（如精氨酸、脯氨酸、组氨酸通路）紊乱显著相关，为PKU的精准诊疗提供了新视角。

　　

苯丙酮尿症（Phenylketonuria, PKU）作为一种常染色体隐性遗传代谢病，因苯丙氨酸羟化酶（PAH）缺陷导致苯丙氨酸（Phe）异常累积，引发神经毒性损伤和多种代谢紊乱。尽管新生儿筛查和饮食管理已显著改善患者预后，但PAH缺陷对全身代谢网络的系统性影响仍未被完全揭示。干血斑（Dried Blood Spot, DBS）技术因其样本量小、稳定性高、便于运输等优势，已成为代谢病筛查的重要工具，然而如何从DBS中高效提取代谢物以全面捕捉PKU的代谢特征，仍是当前研究的瓶颈。

为解决这一难题，研究团队在《Metabolomics》发表了题为"Identification of an extraction protocol from dried blood spots for untargeted metabolomics: application to phenylketonuria"的研究论文。该研究通过系统比较不同提取溶剂（甲醇/水、乙腈/水、甲醇/乙腈/水混合体系）与提取方法（室温振荡、超声、4℃过夜振荡），结合氮吹浓缩步骤优化，最终确立以80%乙腈/20%水为溶剂、4℃过夜温和振荡并辅以氮吹浓缩的方案（Protocol C2）为最优方法。该方案不仅显著提升代谢物提取数量（达2104种），更高效捕获氨基酸及其衍生物，且信号线性范围覆盖50-1500μM Phe浓度，完美适配PKU患者的高Phe浓度检测需求。

关键技术方法包括：基于30例PKU患者和30例健康对照的DBS样本队列，采用液相色谱-串联高分辨质谱（LC-MS/MS）进行非靶向代谢组学分析，通过MzMine软件进行数据预处理，MetaboAnalyst完成统计分析与通路富集，并利用正交偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）和火山图筛选差异代谢物。

3.1 不同DBS提取方案的比较

通过主成分分析（PCA）和PLS-DA模型验证，Protocol C2（乙腈/水体系）与C3（甲醇/乙腈/水体系）提取代谢物数量显著优于其他方案（2104 vs. 300-1350种），且C2对苯丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸等关键氨基酸的提取效率更高。超声处理（Protocol B）则导致多种氨基酸衍生物丢失。

3.2 健康对照DBS中苯丙氨酸浓度梯度验证

在Phe浓度50-1500μM的线性范围内（R2=0.9877），Protocol C2成功区分不同浓度梯度样本，且通路富集分析显示其额外捕获嘌呤代谢和初级胆汁酸合成通路，而C3更侧重甘油磷脂类化合物。

3.3 氮吹浓缩步骤对代谢物检测的影响

氮吹处理显著提升β-丙氨酸、胆碱、脯氨酸、肌酐等174种代谢物的检测灵敏度（fold change>2, p<0.05），证实浓缩步骤对增强信号强度的必要性。

3.5 基于优化方案的PKU代谢特征解析

PCA分析清晰区分患者与对照组，且患者代谢谱随Phe浓度（低<200μM、中200-500μM、高>500μM）呈梯度变化。热图显示患者组中苯丙氨酸、N-苯乙酰谷氨酰胺、鞘磷脂衍生物等显著上调，而十三酰甘氨酸、肌酐等在对照组富集。

3.6 PKU中紊乱代谢通路的识别

通路富集分析揭示苯丙氨酸/酪氨酸代谢、精氨酸/脯氨酸代谢、组氨酸代谢、谷胱甘肽代谢等多条通路显著扰动，证实PKU的代谢影响远超氨基酸累积本身，涉及能量代谢与氧化应激网络。

3.7 氨基酸补充剂对代谢谱的影响评估

尽管18例患者接受氨基酸/糖巨肽补充，其代谢谱与未补充组无显著差异（PLS-DA模型R2=0.19, Q2=-0.52），提示当前补充策略可能未完全纠正深层代谢失衡。

研究结论强调，DBS提取方案C2为PKU的代谢研究提供了高效、稳定的技术支撑，首次系统揭示PKU患者多氨基酸代谢通路协同紊乱的特征。该方案不仅适用于PKU，未来可拓展至其他氨基酸代谢病研究，为精准医疗背景下代谢病的机制探索与干预策略设计提供关键技术支持。讨论部分进一步指出，DBS样本的稳定性与临床适用性虽高，但血细胞比容差异、点样均匀性、储存湿度等因素仍需标准化控制。此外，PAH基因型多样性及补充剂生物利用度差异可能是代谢谱异质性的潜在来源，需通过更大样本队列与多组学整合分析深入探索。