基于液滴数字PCR的克拉霉素耐药性检测预测幽门螺杆菌根除成功率：一项新西兰队列研究

　　本研究创新性地利用液滴数字PCR（ddPCR）技术对快速尿素酶试验（RUT）存档样本进行克拉霉素耐药基因检测，证实该方法可有效预测标准三联疗法根除幽门螺杆菌（H. pylori）的疗效。研究显示耐药组根除率仅38.5%，而非耐药组高达97.2%（p<0.001），表明克拉霉素耐药是治疗失败的主要决定因素，为临床实施个体化治疗和抗生素管理提供了重要依据。

　　

引言

幽门螺杆菌（H. pylori）感染是慢性胃炎、消化性溃疡疾病、黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤和胃腺癌的重要致病因素。全球约半数人口感染该细菌，使其成为全球最普遍的细菌感染。成功根除幽门螺杆菌可显著降低这些并发症的风险。

在新西兰，虽然关于幽门螺杆菌感染患病率的数据有限，但南奥克兰地区的内镜检查患者研究显示，当地人群感染率达18%。欧洲裔人群感染率较低（7.7%），而毛利人（34.9%）、太平洋族裔（29.6%）、亚洲人（23.8%）和印度裔（19.2%）的感染率显著较高。这种感染率的差异导致毛利人和太平洋族裔的胃癌发病率比欧洲裔高出3-6倍。

克拉霉素耐药已被证明是使用标准一线治疗方案奥美拉唑、阿莫西林和克拉霉素（OAC）时幽门螺杆菌治疗失败的主要决定因素。克拉霉素耐药率在国际上所有其他测试人群中均呈上升趋势，在新西兰也可能有所增加。2013年的一项新西兰研究显示，基于培养的耐药性检测中，克拉霉素总体耐药率为16.4%，且在毛利人和太平洋族裔中最高。同一研究发现，克拉霉素耐药率超过15%时，OAC疗法的根除率仅为64.9%。

国际数据表明，抗生素耐药性对甲硝唑和克拉霉素的幽门螺杆菌治疗效果的影响中，甲硝唑耐药使疗效降低37.7%，而克拉霉素耐药使疗效降低55%。在新西兰，虽然克拉霉素耐药比甲硝唑耐药少见，但感染克拉霉素耐药菌株的患者治疗失败的可能性远高得多。重要的是，一线治疗的失败显著增加了抗生素耐药幽门螺杆菌的比例，使得后续的成功根除更加困难。尽管如此，OAC仍然是新西兰推荐的 empiric 一线疗法。

全球克拉霉素耐药率的上升已导致建议在克拉霉素耐药率高（>15%）或耐药率未知的国家，将铋剂四联疗法（BQT）作为 empiric 一线疗法。另一种方法是根据克拉霉素耐药性的存在与否，分别处方BQT或OAC。

直到最近，检测幽门螺杆菌的抗生素耐药性仍需额外获取胃活检组织并进行培养和最小抑菌浓度（MIC）测定，这一过程耗时且需要细菌培养专业知识。为了解决这些困难，全球的微生物学服务正在采用分子方法确定抗菌药物敏感性谱。由于对克拉霉素的耐药性几乎完全由幽门螺杆菌23S核糖体RNA（rRNA）中的少数突变引起，因此可以通过聚合酶链反应（PCR）从活检组织中检测这些突变，无需培养即可相对准确地预测表型耐药。最初，针对幽门螺杆菌抗菌药物耐药性的分子技术专注于胃镜检查时获取的胃组织样本。然而，获取此类样本的相对侵入性和成本也推动了类似技术的发展，这些技术可用于粪便样本，并且与活检样本具有相似的准确性。

中国台湾地区的一项随机对照试验（RCT）表明，在高克拉霉素耐药地区，如果通过抗生素耐药基因检测进行指导，克拉霉素为基础的三联疗法作为一线治疗仍然有效。一项关于该方法的荟萃分析确定了12项包含3940名患者的RCT，并得出结论：基于分子方法的个体化治疗可能比经验性三联疗法提供更好的疗效。

在当前临床实践中，幽门螺杆菌通常通过胃镜检查时进行的快速尿素酶试验（RUT）来诊断。虽然RUT结果通常在胃镜检查时获得，但通常不进行培养活检。因此，如果需要耐药性检测，则需要进行重复胃镜检查并取活检，这既昂贵又具有侵入性。能够使用从阳性RUT中提取的幽门螺杆菌DNA来测试其抗生素耐药性将克服这些问题，并可能提高幽门螺杆菌治疗的成功率。从RUT中提取幽门螺杆菌DNA并测试克拉霉素耐药基因的能力已有充分描述。然而，据我们所知，尚无研究将其用于临床实践以指导治疗或确定其是否可以提高根除成功率。

研究目的

我们进行了一项现实生活中的调查，探讨在内镜检查时储存阳性RUT测试用于未来克拉霉素耐药基因测试的实用性和效用，并确定了这种方法可能对根除率产生的影响。这是首项在临床实践中采用此种方法的研究。

材料与方法

研究对象为在Hutt Valley地区卫生委员会（HVDHB）消化内科接受胃镜检查且快速尿素酶试验（RUT）呈阳性的年龄≥18岁的患者。他们被纳入研究并签署了知情同意书。患者接受标准的幽门螺杆菌治疗，并在标准根除治疗至少6周后，通过幽门螺杆菌粪便抗原测试确认根除。

幽门螺杆菌DNA提取

阳性RUT保存在-20°C。为了收集用于DNA提取的活检样本，将RUT检测盒切开，将其全部内容物（包括样本组织和缓冲液）转移至1.5 mL微量离心管中。装有样本的管子在DNA提取前保存在-20°C。

进行DNA提取时，将样本在室温下解冻，然后高速离心（6000 g，1分钟，室温）以沉淀组织并去除缓冲液上清液。DNA提取按照DNeasy Blood and Tissue试剂盒（QIAGEN，产品编号 69504）的方案进行。通过加入180 μL ATL缓冲液和20 μL蛋白酶K，并在56°C的摇床培养箱（Thermomixer, Eppendorf）中孵育2小时来裂解组织样本。裂解后，加入200 μL AL缓冲液并涡旋混合均匀，然后向每个样本加入200 μL乙醇（96%–100%）。将全部内容物离心通过DNeasy硅胶 spin column，使DNA结合到柱上，并弃去流出液。然后将含有结合DNA样本的 spin column 依次用500 μL AW1、AW2洗涤缓冲液和80%乙醇洗涤。DNA分两次洗脱，第一次用120 μL AE缓冲液洗脱，随后第二次用100 μL AE缓冲液洗脱以实现最大DNA回收率。使用Nanodrop UV-Vis分光光度计（Thermo Scientific）评估DNA浓度和纯度，并将DNA保存在-80°C直至进行PCR测试。将DNA浓度调整至10 ng/μL用于PCR，每个反应使用4 μL稀释后的模板。

PCR引物和探针

用于检测幽门螺杆菌的引物和探针序列如表1所示。所有引物和探针均由IDT（Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, USA）合成。

表1. 本研究中使用的引物和探针

（此处省略具体序列表格内容，包含针对ureA, ureC, 人β-actin, 23S rRNA野生型和突变体（A2142G, A2142C, A2143G）的引物和探针信息，以及它们的修饰和参考文献。）

幽门螺杆菌物种鉴定通过定量PCR进行

使用TaqMan水解探针 assays 扩增幽门螺杆菌脲酶A（UreA）和脲酶C（UreC）基因的片段。作为幽门螺杆菌UreA和UreC基因未扩增时的额外对照，还通过定量PCR（qPCR）检测人β肌动蛋白基因来确认从冷冻活检样本中分离的DNA质量。qPCR在15 μL反应体积中进行，包含1× Luna Universal Probe qPCR Master Mix（Cat# M3004E, New England BioLabs, USA）、每种引物500 nmol/L（表1）、探针250 nmol/L和4 μL DNA模板。热循环反应条件为：初始变性95°C 20秒，随后进行40个循环（95°C 1秒，58°C 20秒），使用TaqMan Fast qPCR程序在Applied Biosystems QuantStudio7 qPCR仪器（ThermoFisher Scientific）上运行。每个样本重复测试两次。

从ATCC（Cat#: 700392D-5）获得幽门螺杆菌野生型参考菌株26695的冻干基因组DNA，并在无核酸酶水中重构至20 ng/μL。为了在qPCR assays 中作为阳性对照，将幽门螺杆菌gDNA制备成七个十倍稀释系列，保存在无核酸酶水中，并分装为单次使用 aliquots 保存于-20°C。

通过液滴数字PCR鉴定幽门螺杆菌23S rRNA

使用Sun等人2018年建立的引物（表1）和方案，对所有样本进行液滴数字PCR（ddPCR） assays，以检测23S rRNA基因中克拉霉素耐药等位基因最常见的存在突变。所有ddPCR assays 在20 μL反应体系中进行，包含1× ddPCR Supermix for Probes（Cat# 1863025, Bio-Rad, USA）、每种引物900 nmol/L（表1）、野生型等位基因HEX探针227 nmol/L、突变型等位基因6-FAM探针227 nmol/L和4 μL DNA模板。热循环反应条件包括：初始变性步骤95°C 10分钟，随后40个循环（94°C 30秒，58°C 1分钟），最后98°C 10分钟1个循环，使用QX200 ddPCR系统（Bio-Rad）进行。

ddPCR程序遵循两级筛选方法：（i）混合突变ddPCR：初始使用所有三种突变FAM标记探针的混合物与野生型（WT）HEX标记探针对所有样本进行筛查。随后（ii）个体突变ddPCR：对步骤（i）中所有突变阳性的样本，分别使用每种突变6-FAM探针与野生型HEX探针进行单独检测。对于初始突变筛查 assay，引物和探针的浓度设定为：正向和反向引物各900 nmol/L，四种探针（即三种6-FAM标记的突变探针A2142G、A2142C、A2143G和HEX标记的野生型探针）各227 nmol/L。对于个体突变鉴定，引物和探针的浓度保持不变，只是将突变探针与野生型探针分开分析。所有反应均重复进行两次。

使用QX Manager软件（版本2.1.0.25，Bio-Rad）分析数据。野生型等位基因（HEX通道）和耐药突变（6-FAM通道）的阳性液滴阈值通过手动设置振幅阈值于阳性液滴簇和阴性液滴簇之间来确定。为了降低 assay 中假阳性的可能性，仅当每个重复反应在相应通道中检测到至少五个液滴时，才判定样本为阳性。

根除确认

使用CerTest幽门螺杆菌抗原快速测试（CerTest Biotec, Spain）评估根除情况，这是一种侧流免疫 assay，用于检测粪便中的幽门螺杆菌抗原。样本在治疗后≥6周收集，并按照制造商的说明在收集后72小时内进行测试。参与者在测试前至少停用质子泵抑制剂（PPI）10天。阳性结果表示治疗失败；阴性结果确认根除。该测试报告的敏感性和特异性均>90%。

样本量计算

我们估计，一个足以改变关于一线治疗选择的临床实践的重要差异是，克拉霉素耐药基因检测阳性者的根除率降低约50%。因此，我们的研究旨在检测到，在没有克拉霉素耐药基因的患者中，OAC的根除率从85%下降到耐药基因阳性者的45%。我们估计我们人群中耐药基因阳性率为20%。在置信水平95%和效能80%的情况下，这需要70名患者（12名耐药基因阳性患者和58名基因阴性患者）的样本量。我们目标是招募至少80名患者，以允许任何因样本处理问题而导致的脱落。

伦理批准

本研究经新西兰健康与残疾伦理委员会（HDEC）评估，被确定为无需进行全面伦理审查的最低风险观察性研究（HDEC参考号：20/STH/61）。因此，不需要HDEC批准。获得了Hutt Valley DHB研究办公室的当地批准（研究编号#63），该研究根据审计和观察性研究的机构政策进行。

结果

共连续招募了84名在内镜检查中RUT呈阳性的同意患者。男性略占优势（57.1%）。种族分布与惠灵顿人口分布相比，欧洲裔较低（48.8% vs. 72.6%），毛利人相同（15.5%），所有其他群体均较高（亚洲人17.9% vs. 15.2%，太平洋族裔8.3% vs. 9.1%，中东/拉丁美洲/非洲裔（MELAA）9.5% vs. 2.3%），但毛利人和太平洋族裔的百分比低于预期，因为已知他们的幽门螺杆菌患病率高于一般人群。内镜检查的适应症范围广泛，最常见的发现是正常或胃炎/十二指肠炎（表2）。

表2. 患者人口统计学特征

（此处省略具体表格内容，包含年龄、性别、种族、内镜检查适应症和内镜检查发现的具体数字和百分比。）

通过PCR检测UreA和/或UreC基因来确定样本中是否存在可检测到的幽门螺杆菌DNA。使用qPCR发现67个（80%）样本为UreA/C阳性。使用ddPCR检测，也有67个（80%）样本（66个UreA/C阳性和1个UreA/C阴性）对23S rRNA基因呈阳性，而67个UreA/C阳性样本中有1个对23S rRNA基因呈阴性，表明这些 assays 在检测幽门螺杆菌DNA存在方面具有高度一致性。

在67个23S rRNA阳性的样本中，全部携带野生型等位基因。共有13个（15.5%）样本还检测到克拉霉素耐药基因呈阳性。在13个具有克拉霉素耐药基因的样本中，10个（76.9%）是A2143G突变，1个（7.7%）是A2142C，1个（7.7%）是A2142G，1个（7.7%）同时具有A2143G和A2142G突变（图S1）。

按种族划分的克拉霉素耐药基因患病率如表3所示。尽管由于样本量小导致置信区间较宽，但个别种族的耐药患病率范围在12.5%至17.1%之间。当毛利人和太平洋族裔合并时，患病率为15.0%（95% CI: 5.2%–36.0%），与所有其他群体的15.6%（95% CI: 8.7%–26.4%）相似。未观察到显著差异。

表3. 按种族划分的克拉霉素耐药基因患病率

（此处省略具体表格内容，包含不同种族群体的耐药患病率和95%置信区间。）

所有患者均接受了根除治疗；然而，鉴于本研究的现实世界性质，研究者并未影响所给予的治疗。65名（77.4%）患者接受了奥美拉唑、阿莫西林和克拉霉素三联疗法（OAC）；54名（64.3%）为期7天，10名（11.9%）为期14天，1名（1.2%）为期10天。14名（16.7%）患者接受了奥美拉唑、甲硝唑和克拉霉素三联疗法（OMC）；10名（11.9%）为期7天，3名（3.6%）为期14天；1名患者的持续时间未知。5名（6%）患者所接受治疗的性质和持续时间无法获取（图1）。由于是观察性设计，未系统收集不良事件和耐受性数据。

图1. 接受不同治疗和持续时间的患者数量。OAC，奥美拉唑、阿莫西林、克拉霉素。OMC，奥美拉唑、甲硝唑、克拉霉素。

在84名接受一线三联疗法治疗的患者中，74名（88.1%）实现了根除（95% CI: 79.5%–93.4%）。克拉霉素耐药基因的存在与治疗失败密切相关：耐药者的根除率仅为38.5%（95% CI: 7.8%–69.1%），而无耐药者为97.2%（95% CI: 93.2%–101.1%）（χ2 = 36.13, p < 0.001）（图2）。在具有克拉霉素耐药基因的患者中，治疗失败患者的中位突变型23S rRNA等位基因浓度有高于成功根除患者的趋势（39.04 copies/ng [IQR 10.87 至 197.0] vs. 7.90 copies/ng [0.95 至 33.81], p = 0.09）（图3）。

图2. 按克拉霉素耐药基因状态划分的幽门螺杆菌根除率，附95%置信区间。

图3. 根除失败患者与成功根除患者之间突变型23S rRNA等位基因浓度（copies/ng）的比较。当存在两个突变基因时，将两个基因的浓度相加。中位数带IQR。数据使用Mann-Whitney U检验进行分析。

治疗成功根除幽门螺杆菌的患者与治疗失败的患者之间，23S rRNA等位基因（野生型或突变型）的浓度没有显著差异（中位浓度75.74 copies/ng [IQR 31.03 至 293.9] vs. 96.73 copies/ng [33.22 至 468.7], p = 0.41）。接受OAC治疗的患者根除率（84.6%）在数值上高于接受OMC治疗的患者（78.6%），但这种差异无统计学意义（p = 0.37）。同样，根除率在不同治疗持续时间之间也没有显著差异（p = 0.32）。未观察到根除与患者年龄、性别、种族或检测幽门螺杆菌DNA的能力之间存在关联（表4）。

表4. 按人口统计学因素划分的根除人数

（此处省略具体表格内容，包含性别、种族、治疗方案、治疗持续时间、幽门螺杆菌DNA检测状态和年龄与根除结果的关联及卡方检验p值。）

讨论

本研究证明了在新西兰（NZ）的真实世界队列中，对储存的快速尿素酶试验（RUT）样本进行克拉霉素耐药基因检测的可行性和临床实用性。我们的研究结果强化了克拉霉素耐药是标准三联疗法根除失败的主要决定因素，这与国际文献一致。

我们研究中观察到的总体根除率（88.1%）与克拉霉素耐药率低地区标准经验性三联疗法的全球基准一致。然而，耐药患者与非耐药患者之间根除成功率的显著对比（38.5% vs. 97.2%）凸显了经验性疗法在耐药阳性病例中的不足。这反映了其他克拉霉素耐药率升高地区的发现，其中标准三联疗法在存在耐药性的情况下根除率显著下降。例如，一项系统综述和荟萃分析报告，当使用克拉霉素为基础的三联疗法时，克拉霉素敏感菌株的根除率为89%，而耐药菌株为43.5%。

所有10名一线治疗失败的患者均接受了7天治疗。虽然只有一名已知耐药突变的患者接受了更长的疗程，且一名患者的治疗持续时间无法确定，但这种模式与国际建议一致，即支持在存在克拉霉素耐药的情况下延长治疗时间。相比之下，54名未检测到耐药突变的患者中有53名成功治疗，其中大多数接受了7天疗法，突显了在不存在耐药性的情况下较短方案仍然有效。尽管在我们的队列中无统计学意义，但这些观察结果支持当前的指导，并强调了将耐药性检测纳入治疗决策的潜在价值。

目前，新西兰指南推荐三联疗法作为一线方案；然而，我们的数据表明，这种经验性方法对于临床上具有重要意义的一部分患者可能不再足够。在这个真实世界队列中，克拉霉素耐药率为15.5%，并且与治疗失败密切相关，继续依赖经验性三联疗法会使患者面临无效治疗、可避免的副作用和延迟根除的风险。

本研究的一个关键优势是使用RUT样本进行耐药基因检测，避免了额外活检的需要，并促进了与常规临床工作流程的整合。我们的方法与国际指南建议一致，倡导在可行的情况下进行分子药敏测试。此外，接受标准治疗的耐药阴性患者的高根除率表明，PCR指导的个体化治疗可以在避免不必要使用四联方案的同时保持疗效，从而加强抗生素管理。研究结果支持临床实践向基于分子耐药性检测的分层治疗方法转变。实施这种策略可以保留克拉霉素为基础方案对敏感患者的疗效，同时将耐药患者导向更合适的替代方案。这些结果也加强了在新西兰进行随机对照试验的理由，以比较PCR指导的个体化治疗与经验性治疗，评估我们医疗背景下的临床结果和成本效益。

虽然本研究侧重于通过RUT诊断的二级护理患者，但其他地方已经证明了将耐药基因检测应用于粪便样本的可行性。如果个体化治疗方法在此队列中被证明有效，则为将这种方法学扩展到初级护理和筛查人群使用粪便基础检测提供了强有力的理由。需要进一步的研究来验证这种扩展。

在本研究中，毛利/太平洋族裔与其他种族群体之间的耐药基因患病率（15.5%）没有显著差异。这一结果与先前进行的一项新西兰研究形成对比，该研究检查了接受胃镜检查患者的克拉霉素耐药率，并显示毛利/太平洋族裔的克拉霉素耐药率远高于新西兰欧洲裔。重要的是，两项研究的样本量都较小，限制了得出明确结论。需要更大规模、具有人群代表性的研究来澄清耐药患病率方面可能存在的种族差异，并为有针对性的干预措施提供信息。

本研究允许治疗临床医生选择治疗方案的现实世界设计反映了标准临床实践，但也引入了变异性。然而，根除成功率在不同方案（OAC vs. OMC）或治疗持续时间方面没有显著差异，进一步支持耐药状态而非方案选择是结果的主要决定因素。这些发现与更广泛的荟萃分析相呼应，表明基于耐药谱的个体化治疗与经验性三联疗法方案相比，无论治疗时间长短，都能提供更好的根除率。

本研究有几个局限性。首先，其单中心设计和专注于胃镜检查患者限制了对更广泛的社区基础人群的普遍性，特别是那些在初级护理中管理或作为筛查项目目标的人群。可能存在选择偏倚，胃镜检查患者可能代表病情更严重或更难治的患者。此外，虽然研究效力足以检测耐药组之间的根除率差异，但总体样本量适中限制了亚组分析（包括按种族或特定耐药突变）的统计效力。

另一个局限性涉及20%的样本中通过PCR未检测到幽门螺杆菌DNA（UreA/C）。这些样本无法评估耐药基因，可能是因为它们并非真正感染、发生了DNA降解或技术因素损害了检测。这17个未检测到幽门螺杆菌DNA的样本给我们的耐药患病率和治疗效果的估计带来了一些不确定性。如果这些病例不成比例地含有因PCR失败而遗漏的耐药菌株，那么真实的耐药患病率会更高，并且观察到的与治疗失败的关联可能会减弱。然而，即使在所有17名DNA阴性患者都被假设为耐药的最保守情况下，耐药阳性组的根除率（70.0%）仍然显著低于耐药阴性组（98.1%，p < 0.001），强化了所观察到关系的稳健性。

相反，如果这些患者在初始RUT测试中是假阳性且从未真正感染，那么无论采用何种疗法，他们的 apparent 根除都是预期的。排除这些病例模拟了一种患者并非真正感染的场景，提供了治疗效果的保守估计。当将分析限制在PCR确认的幽门螺杆菌感染患者时，耐药阳性病例的根除率为38.5%，耐药阴性病例为98.1%，支持相同的结论：克拉霉素耐药是根除失败的关键决定因素。

技术问题也可能影响PCR灵敏度。虽然储存的RUT组织在大多数情况下被证明可用于耐药基因检测，但样本质量和储存条件的可变性可能会影响DNA完整性和扩增。最后，由于这是一项观察性研究，未测量的混杂因素，如患者依从性、抗生素暴露史和合并症，可能影响了根除结果。

结论

总之，这些结果凸显了基于ddPCR的克拉霉素耐药性检测在新西兰的临床相关性，以及PCR指导的个体化治疗优化根除结果的潜力。将耐药性检测纳入常规幽门螺杆菌管理可能会改善患者结局和抗生素管理，支持在该领域向个性化医疗的转变。

作者贡献

概念化：S.J.I.和S.S.。方法论：S.J.I.。形式分析：S.J.I.。招募和数据收集：S.S.和T.M.。实验室分析：B.Y., K.P., G.W., 和 M.C.。写作 – 初稿准备：S.J.I.。写作 – 审阅和编辑：T.M.。所有作者均已阅读并同意稿件的出版版本。

致谢

开放获取出版由奥塔哥大学通过澳大利亚大学图书馆员委员会与Wiley的协议促成。

伦理声明

本研究根据《赫尔辛基宣言》进行。本研究经新西兰健康与残疾伦理委员会（HDEC）评估，被确定为无需进行全面伦理审查的最低风险观察性研究（HDEC参考号：20/STH/61）。因此，不需要HDEC批准。获得了Hutt Valley DHB研究办公室的当地批准（研究编号#63），该研究根据审计和观察性研究的机构政策进行。

同意

所有参与研究的受试者均获得了知情同意。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。