新型尤文肉瘤细胞系的建立与多组学表征：拓展EWSR1::FLI1融合变异型IV模型并揭示TP53突变对药物敏感性的影响

　　本文报道了四种新型人源尤文肉瘤（EwS）细胞系的建立与多组学表征，这些模型均携带t(11;22)(q24;q12)易位产生的致癌转录因子EWSR1::FLI1，其中首次在连续培养模型中描述了外显子7/7融合的类型IV变异。研究通过全外显子测序（WES）、全基因组测序（WGS）和甲基化芯片分析，揭示了TP53、STAG2和CDKN2A/B突变的关键作用，并证明TP53突变状态显著影响药物敏感性谱。这些模型为靶向EWSR1::FLI1融合蛋白的小分子抑制剂开发和表观遗传/转录组脆弱性研究提供了宝贵资源。

　　

1 引言

尤文肉瘤（EwS）是一种罕见的高度侵袭性恶性骨与软组织肿瘤，好发于儿童、青少年和年轻成人。尽管采用包括高剂量化疗联合干细胞移植和靶向药物在内的强化多模式治疗，仍有三分之一非转移性患者发生复发，生存率低于30%。EwS的特征性事件是EWSR1基因与ETS家族转录因子（主要为FLI1）的染色体易位，形成致癌嵌合转录因子。断点区域差异导致不同的易位亚型，其预后意义尚不明确。次级遗传异常如TP53和STAG2突变、chr9p缺失和CDKN2A缺失以及chr8、chr2、chr1q或chr20的扩增较为罕见但可促进肿瘤维持。TP53和/或STAG2突变与不良预后和治疗耐药相关。由于缺乏合适的动物模型，EWSR1::FLI1驱动的细胞起源研究面临挑战。患者来源的癌细胞系能捕捉疾病状态、进展、易位亚型、治疗反应和突变负荷等广泛特征，是研究EwS临床异质性的有用工具。本文描述了四种新型内源性永生化患者来源EwS细胞系的建立和表征，通过基因组、转录组和表观基因组分析结合定制药物库筛选，提供了经过全面筛选的EwS模型，并首次报道了携带EWSR1::FLI1类型IV（外显子7/外显子7）易位的EwS细胞系。

2 材料与方法

2.1 细胞培养与新EwS细胞系建立

实体肿瘤样本经胰酶消化后过滤去除残留团块，红细胞裂解后重悬于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，接种于大鼠胶原包被的T25培养瓶。腹水样本离心后直接培养。细胞按增殖行为进行传代，未添加永生化因子。C-ES-I在IMDM+10%FBS中生长最优。所有细胞系定期检测支原体污染。

2.2 支原体污染检测

采用PCR方法检测培养上清中的支原体特异性序列，通过琼脂糖凝胶电泳可视化产物。

2.3 荧光端粒重复扩增协议 assay（f-TRAP）

该荧光基础方法用于测定哺乳动物细胞和组织样本的端粒酶活性，涉及荧光标记引物延伸、PCR扩增和毛细管电泳检测。

2.4 PCR与Sanger测序

RNA提取后逆转录，使用EWSR1外显子7和FLI1外显子9特异性引物扩增融合转录本。TP53扩增条件优化后，纯化产物进行Sanger测序。

2.5 Western blot

细胞裂解后使用抗FLI1抗体检测EWSR1::FLI1融合蛋白（约68kDa特征条带），β-肌动蛋白作为内参。

2.6 增殖速率测定

台盼蓝排斥法计数活细胞，通过公式计算群体倍增时间（PDT）：PDT = (t₁ - t₀) × log(2) / log(n₁ / n₀)。

2.7 STR谱分析样本制备

gDNA提取后采用16个标记位点的复合PCR系统进行短串联重复（STR）分析，与DSMZ和ATCC数据库比对验证独特性。

2.8 BAT-26和BAT-25分析

荧光标记引物扩增单核苷酸重复序列，毛细管电泳分析微卫星不稳定性（MSI）。

2.9 WES、WGS和甲基化芯片样本制备

细胞培养96小时后提取DNA，满足质量要求后进行全外显子测序（WES）、全基因组测序（WGS）和Illumina甲基化EPIC v2.0芯片分析。

2.10 CNV calling

WGS数据比对至GRCh38基因组，使用cnvkit分析拷贝数变异（CNV）和倍性，过滤非规范染色体。

2.11 变异 calling

WES数据经Varlociraptor流程调用单核苷酸变异（SNV）、多核苷酸变异（MNV）、插入缺失等。筛选OncoKB癌症基因列表中具有"高"影响或"致病性"临床意义的变异。

2.12 Affymetrix微阵列样本制备

RNA提取后使用人Affymetrix Clariom D平台进行基因表达分析。

2.13 基因表达分析

R语言分析微阵列数据，采用msigdbr包进行基因集富集分析（GSEA），topGO包进行过表达分析（ORA）。

2.14 DNA甲基化分析

Illumina甲基化芯片数据采用标准流程分析。

2.15 药物敏感性谱分析

384孔板预置80种药物（浓度梯度五数量级），每孔接种1000个细胞，72小时后CellTiter-Glo检测ATP水平。iTreX计算不对称药物敏感性评分（DSS_asym）。

3 结果

3.1 患者信息

肿瘤样本来源于儿科和年轻成人EwS患者的诊断或复发时期，均经病理证实EWSR1::FLI1易位。样本包括股骨原发肿瘤（C-ES-Y）、肺转移进展（C-ES-I）、复发腹水（C-ES-M）和肱骨二次复发（C-ES-P）。所有患者最终均死于疾病。

3.2 遗传稳定性、真实性与永生化

早期和晚期传代STR谱分析显示细胞系独特性，与患者样本STR谱一致。连续培养6个月后STR位点杂合性保持不变。STA-ET-1出现等位基因漂移。BAT25/26标记证实C-ES系列为微卫星稳定（MSS），而STA-ET-1显示MSI。f-TRAP assay证实所有细胞系端粒酶激活（TA），支持永生化状态。

3.3 形态学与增殖速率

细胞形态多样：C-ES-I细胞体大而铺展；C-ES-M小而呈纤维样；C-ES-P具针状突起；C-ES-Y大小不均。所有细胞贴壁生长，C-ES-Y低密度时易形成松散球体。增殖测定显示A-673 PDT为22小时，STA-ET-1为27小时，C-ES-I和C-ES-M约26-27小时，C-ES-Y为32小时，C-ES-P最低（62小时），与传代比率相符。

3.4 EWSR1::FLI1易位确认

PCR和Western blot证实所有新细胞系存在EWSR1::FLI1融合转录本和蛋白（68kDa特征条带）。Sanger测序揭示不同外显子连接：C-ES-M和C-ES-Y为外显子7/5融合（类型II），C-ES-P为外显子7/6融合（类型I），C-ES-I为外显子7/7融合（类型IV）。类型IV融合为首次在连续EwS模型中描述。

3.5 典型染色体异常

CNV分析显示8号染色体扩增（EwS最常见增益）。C-ES-MCNV较少，C-ES-I随时间显著变化。C-ES-I和C-ES-M存在CDKN2A/B纯合缺失，C-ES-P为单拷贝缺失。STA-ET-1和SK-N-MC分别显示STAG2单拷贝缺失和纯合缺失（外显子2-17）。

3.6 EwS常见额外突变识别

TP53为最常见突变：C-ES-I携带R273L和P72R（杂合）；C-ES-M为P72R（杂合）；C-ES-P为H179R和P72R（纯合）；C-ES-Y为C176F（纯合）；STA-ET-1为P72R（杂合）。C176F、H179R和R273L位于DNA结合域（DBD），丧失反式激活功能并增强迁移侵袭。P72R多态性可修饰DBD突变体功能。SK-N-MC存在TP53起始密码子纯合缺失。STAG2 truncating突变：C-ES-P的E1224和C-ES-Y的R216（完全缺失）。其他常见变异涉及ATM、ERBB2/HER2、FGFR3、FGFR4、NF1、NOTCH1、SMO和SETD2。亚克隆变异分析表明培养期间未诱导新遗传变异。

3.7 影响转录变异的潜在因素

微阵列PCA分析显示前两个主成分（PC1+PC2=39.7%方差）按TP53 DBD突变状态分组。GSEA显示DBD突变细胞富集MYC靶点V1、E2F靶点、氧化磷酸化、G2M检查点、mTORC1信号等通路。ORA揭示TP53相关GO条目富集。PC3（12.4%方差）按融合类型分组，类型II比类型I富集G2M检查点、E2F靶点等。类型IV细胞位于类型I和II之间。PC4（11.7%方差）分离C-ES-M和C-ES-P，富集MYC靶点V2、KRAS信号上调、DNA修复等，提示DNA损伤反应和能量代谢改变。培养时间对转录谱影响较小。

甲基化PCA显示PC1（33%方差）按融合类型分组，PC2（30%方差）按TP53状态分组。TP53 DBD突变与野生型比较发现1696个差异甲基化区域，其中24个基因差异表达；类型II与类型I比较发现2486个差异甲基化区域，其中8个基因差异表达。

3.8 细胞系呈现不同药物敏感性谱

标准化疗药物（长春新碱、多柔比星、依托泊苷、4OOH-异环磷酰胺）敏感性显示新细胞系比EW-7和STA-ET-1更耐药。80种药物筛选的层次聚类按药效分组，反映TP53突变状态。TP53 DBD突变细胞对MDM2抑制剂（idasanutlin、AMG-232）和化疗药（依托泊苷、长春新碱）敏感性降低，对BCL-XL抑制剂A-1155463敏感性增加。C-ES-P对A1331852敏感性低，对Navitoclax敏感。C-ES系列对多柔比星和替莫唑胺耐药，对长春瑞滨最敏感（除C-ES-I）。C-ES-I对伊立替康、拓扑替康和凋亡调节剂A-1331852、A-1155463最敏感。

4 讨论

研究验证了四种新EwS细胞系的真实性、永生化性和稳定性。端粒酶激活支持易位肉瘤通过表观遗传重编程永生化。多组学分析显示典型染色体异常（8号染色体增益、CDKN2A缺失）和TP53、STAG2突变。细胞系中突变发生率高于患者，可能与侵袭表型、培养选择或亚克隆优势有关。C-ES-I为首个类型IV融合EwS细胞系，拓展了模型光谱。转录组中融合类型和TP53 DBD状态影响表达变异，但大规模研究中这些因素未显示主要作用。肿瘤异质性机制研究可能改善未来靶向治疗。所有细胞系来源于预后不良患者，药物谱显示TP53 DBD突变细胞反应差异，但长春瑞滨在突变和野生型细胞均高效。SK-N-MC和STA-ET-1 characterization显示STAG2完全和部分缺失。新细胞系为研究EWSR1::FLI1重编程机制和转录域在肿瘤发生中的作用提供了资源。