东非不同地理区域Mondia whitei微生物组与代谢组的互作机制及其药用潜力研究

　　本研究通过高通量测序（16S rRNA/ITS）和色谱-质谱联用技术（GC/LC-MS）揭示了药用植物Mondia whitei根际与根内微生物组的空间特异性及其与86种代谢产物（如fraxin、4-甲氧基苯甲醛等）的强相关性，为解析植物-微生物-代谢物互作网络提供了新视角，对非洲传统药用植物的可持续开发具有重要价值。

　　

引言

非洲蕴藏着高度多样化的微生物组资源，其在全球植物、土壤和人类微生物组数据库中仍未被充分表征。传统草药医学世代为非洲原住民社区的健康和韧性做出贡献，其中Mondia whitei（Hook.f.）Skeels是撒哈拉以南非洲地区特有的重要药用植物。这种多年生草本攀缘植物属于夹竹桃科（Apocynaceae），因其野生根部的广泛采集而被列为濒危物种，亟需研究以支持其保护和可持续利用。

Mondia whitei的根部具有类似香草的强烈芳香，传统上被用于壮阳、治疗胃痛、疟疾感染、肠道寄生虫感染以及缓解压力等。其药理活性包括抗菌和抗炎特性，但其完整的代谢组及其与微生物组的相互作用尚未得到充分探索。植物-代谢组-微生物组的相互作用在植物发育早期即已启动，根际作为动态代谢交换的主要界面，植物通过分泌根系分泌物（包括芳香有机酸和次级代谢产物）主动塑造微生物群落，而建立的根际微生物群又通过改变根系分泌物谱和次级代谢产物生产来影响植物代谢，形成一个复杂的反馈驱动系统。

材料与方法

采样与处理

从乌干达五个地点（Kabuye、Kitwanga、Kisorosoro、Kagogo和Kito）获取根和根际样本，每个地点八个生物学重复。样本经国际运输至奥地利格拉茨环境生物技术研究所进行处理。使用0.85%氯化钠溶液分离根际，离心获取根际沉淀，根部样本经液氮研磨。DNA提取使用FastDNA Spin Kit for Soil，并通过NanoDrop 2000分光光度计定量。

微生物丰度测定与扩增子测序

通过定量实时PCR（qPCR）估算微生物丰度，使用引物对Unibac-II-515f/Unibac-II-806r（细菌16S rRNA基因）和ITS1f/ITS2r（真菌ITS区域）。采用两步PCR程序扩增细菌和真菌标记基因，并使用肽核酸（PNA）PCR夹板阻断质体和线粒体16S rRNA基因的扩增。第二次PCR连接样本特异性条形码，扩增产物经纯化后进行Illumina MiSeq 2×300测序。

生物信息学分析

使用Cutadapt进行质量检查和去复用，DADA2算法进行质量过滤、修剪、去噪、合并和嵌合体去除，生成扩增子序列变体（ASVs）。通过VSEARCH在QIIME 2中对去噪序列进行物种分类，参考数据库为SILVA132（细菌）和UNITE v7（真菌）。使用phyloseq和vegan包处理微生物ASV表和物种分类，移除与叶绿体、线粒体和古菌相关的非细菌ASVs。数据集通过Ranacapa包进行稀释处理，使用累积和缩放（CSS）标准化进行β多样性分析。

统计分析

使用Kruskal-Wallis检验比较不同地点和区室（根内与根际）的微生物α多样性，Dunn's检验进行多重比较。通过置换多元方差分析（PERMANOVA）和主坐标分析（PCoA）检验地理地点和区室对微生物群落结构的影响。使用DESeq2进行差异丰度分析，随机森林分类器（RFC）基于ASVs的重要性对地理地点进行分类。通过多任务弹性网络回归和留一法交叉验证模拟化合物与根微生物组之间的关联。

结果

地理区域对M. whitei微生物组的影响

地理地点是塑造细菌和真菌群落组成的主要因素（细菌：R²=15%，p=0.001；真菌：R²=15%，p=0.001），植物区室也对群落变异有贡献（细菌：R²=5%，p=0.001；真菌：R²=10%，p=0.001）。地点和植物区室对微生物群落组成有显著的交互作用（细菌：R²=8%，p=0.001；真菌：R²=12%，p=0.001）。PCoA可视化显示细菌和真菌群落在地理地点和植物区室上的聚类分离。

根内和根际细菌群落以变形菌门（Proteobacteria）为主，根内平均丰度为67%，根际为60%，其次是放线菌门（Actinobacteria）（根内16%，根际14%）。优势细菌类群为γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）（根内52%，根际41%）和α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）（根内13%，根际19%）。真菌群落以子囊菌门（Ascomycota）为主（根内75%，根际88%），优势类群为粪壳菌纲（Sordariomycetes）（根内51%，根际62%）和座囊菌纲（Dothideomycetes）（根内12%，根际15%）。

微生物多样性的影响因素

细菌丰富度和香农指数在不同地点间存在显著差异（p=4×10^?6和p=3×10^?7），而区室间无显著差异。真菌丰富度和香农指数在区室间有显著变异（p=1×10^?8和p=1×10^?6），地点间无显著差异。区室特异性分析显示，根际和根内细菌群落丰富度和多样性在不同地点间有显著变异，真菌群落的显著差异仅见于根际。微生物平均丰度在根际（6×10⁹至10×10¹¹基因拷贝/克）和根内（1×10¹⁰至6×10¹⁰基因拷贝/克）相似。

根内微生物组的来源

核心微生物组包括细菌属Noviherbaspirillum和真菌属Fusarium、Mortierella、Penicillium等。根际含有349个细菌ASVs和205个真菌ASVs，根内含有425个细菌ASVs和131个真菌ASVs。SourceTracker分析显示，80%–95%的细菌和65%–90%的真菌微生物组可能从根际转移到根内，未知来源的根内微生物组比例分别为5%（细菌）和25%（真菌）。

根内微生物组的差异丰度与地理分界

22个细菌和7个真菌ASVs在根内显著富集，7个细菌和21个真菌ASVs在根际更丰富。基于差异丰度ASVs的群落聚类显示地理地点的明显分离。随机森林分类器对地理地点的测试准确度为0.9±0.05，最重要的ASVs包括细菌属Actinophytocola、Pseudomonas、Bacillus和真菌属Penicillium、Cylindrocladiella等。

微生物组与代谢物的关联

根代谢组包含120种化合物，与微生物组数据集进行相关性分析。多任务弹性网络回归模型（R²=0.53）显示，化合物如十二烷酸、fraxin、全氟壬酸（PFNA）、邻苯二甲酸单丁酯和4-甲氧基苯甲醛与细菌属Lactococcus、Pseudomonas和Bacillus强相关。真菌属Mortierella、Stagonosporopsis等与代谢物如十二烷二酸、scopoletin、对苯二甲酸等相关。苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛等与Penicillium相关，而fraxin、苯甲醛等与Fusarium负相关。

文献调查显示，M. whitei代谢组包含多种具有抗菌活性的化合物，如4-甲氧基苯甲醛、D- germacrene、2-戊基呋喃等。水杨酸甲酯（植物免疫活性化学物质）和scopoletin（具有抗肿瘤、抗炎和神经保护特性的香豆素）也在根中检测到。二糖海藻糖（α,α-trehalose）在所有地点的样本中均存在，其在资源限制条件下作为能源和信号分子发挥作用。

讨论

本研究揭示了M. whitei全息体中微生物组与代谢组之间的相互作用。植物微生物组组成主要受样本地点影响，其次是区室。微生物多样性在不同地点间存在变异，根内微生物组的大部分可能来源于根际。植物微生物组与特定根代谢物相关，某些化合物具有地点特异性。

植物微生物组从种子和周围土壤中组装，沿土壤-根际-根内连续体形成微生物梯度。根际微生物多样性较高，部分源于根系分泌作用。根际微生物群在调节植物生长、健康和病原体防御中起关键作用。微生物组组成受生物和非生物因素影响，随时间和空间变化，解释了不同地理地点和区室间的微生物组差异。地点间的微生物组差异可能源于环境条件（如土壤理化特性）的变异，这些条件也塑造根代谢组，表明M. whitei根具有地方微生物和代谢指纹。

微生物组主要由细菌门变形菌门、放线菌门、拟杆菌门等和真菌门子囊菌门、担子菌门组成，与其他植物物种（如拟南芥和水稻）相似。变形菌门主要包含γ-变形菌纲和α-变形菌纲，根内γ-变形菌纲尤为丰富。优势真菌类群为粪壳菌纲和座囊菌纲，根内粪壳菌纲较多。不同地点共享的 taxa包括细菌属Pseudomonas、Mycobacterium、Streptomyces等和真菌属Metarhizium、Fusarium、Mortierella等。一些细菌属（如Pseudomonas、Bacillus）作为生物肥料和生物保护剂有益，真菌属Metarhizium和Purpureocillium包含农业重要菌株。

M. whitei根含有多种具有抗菌特性的化合物，其广泛消费部分源于草药用途。研究发现2-羟基-4-甲氧基苯甲醛高丰度存在，其为主要的酪氨酸酶抑制剂。其他代谢物如香豆木脂素、单宁和类黄酮以及挥发性芳香化合物（如4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）也在根中富集。邻苯二甲酸单丁酯对斑马鱼肝脏抗氧化系统有潜在毒性，海藻糖作为能源和信号分子广泛存在。

结论

植物微生物组主要受地理地点和植物区室影响，部分微生物组与特定根代谢物相关，能够区分不同样本来源。本研究为植物资源和微生物群落（包括代谢物）的可持续开发提供了初步探索，有助于拓展药用植物如M. whitei的植物-微生物组-代谢组相互作用研究前沿。这些见解反映了微生物组在植物生物活性化合物生物合成中的潜在作用，根化合物与特定（大多不可分类）微生物类群之间的联系为生物活性代谢物的生物勘探提供了视角。未来研究应考虑探索潜在风险，如由于抗菌代谢物的普遍存在，M. whitei根微生物组可能携带的抗菌耐药性负荷。