垂体腺苷酸环化酶激活肽-38（PACAP-38）在丛集性头痛中的前瞻性病例对照研究：一个潜在治疗靶点的探索

　　本研究通过前瞻性病例对照设计，首次在大规模人群中证实丛集性头痛（CH）患者不同疾病状态（发作期、缓解期、慢性期）的血浆垂体腺苷酸环化酶激活肽-38（PACAP-38）水平均显著高于无头痛对照组（HC），其中慢性CH患者升高幅度达49.8%（p<0.0001）。研究同时发现降钙素基因相关肽（CGRP）水平在各组间无显著差异，且PACAP-38与CGRP水平无相关性（Spearman r=0.08, p=0.10）。这些发现为PACAP-38靶向治疗丛集性头痛的临床试验提供了坚实理论基础。

　　

研究背景与意义

丛集性头痛（Cluster Headache, CH）被公认为最剧烈的疼痛性疾病之一，其病理生理机制尚未完全阐明。近年来，除降钙素基因相关肽（Calcitonin Gene-Related Peptide, CGRP）外，垂体腺苷酸环化酶激活肽-38（Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide-38, PACAP-38）作为一种新兴生物标志物受到广泛关注。PACAP-38是一种多效性神经肽，通过在下丘脑和三叉神经节等关键结构的活动，在原发性头痛的伤害感受过程中发挥核心作用。既往研究表明，PACAP-38在偏头痛患者中水平升高，且靶向治疗已显示出预防性减少发作的效果。多项证据支持PACAP-38参与CH病理过程：PACAP-38及其受体在颅骨副交感神经元和下丘脑中均有表达，这两个区域被认为是CH发作特征的核心参与者；之前的诱发研究通过全身输注再现了疼痛发作，并在中止PACAP-38合成时疼痛水平消退。尽管如此，未来治疗试验的基础仍然有限，因为CH中PACAP-38的基线血浆水平仅被系统研究过两次，且样本量小，结果存在分歧。

研究方法

本研究采用前瞻性观察性病例对照设计，是丹麦丛集性头痛生物库（Danish Cluster Headache Biobank）的一部分。生物库包含2018年10月至2021年12月期间在丹麦头痛中心（Rigshospitalet-Glostrup）前瞻性收集的血样，来自发作期和缓解期的发作性CH（episodic CH, eCH）患者、慢性CH（chronic CH, cCH）患者和无头痛对照组（Headache-free Controls, HC）。CH参与者根据现行ICHD-3标准诊断，年龄在18至80岁之间。排除标准包括除CH外的慢性头痛、当前已知药物滥用、严重躯体或精神共病、妊娠和哺乳。允许使用稳定的CH预防性药物，但采样前30天内使用类固醇（口服和枕大神经阻滞）则被排除。HC通过社交媒体和医院周边通知招募，按性别和年龄以1:1比例与eCH组匹配，无原发性或继发性头痛病史（偶发性紧张型头痛、酒精延迟性头痛或感染相关头痛除外），采样前7天内不允许有任何类型的头痛。

参与者被分为：cCH、eCH发作期或eCH缓解期。eCH发作期定义为发作性且前一周有超过一次发作；eCH缓解期定义为至少连续三周无发作。首次发作期招募的参与者被随访直至缓解或1年后可诊断为cCH。cCH或HC参与者采样一次，eCH参与者采样两次（分别处于发作期和缓解期）。所有参与者被指示采样前至少禁食8小时，2小时内不饮用任何液体。采样日进行结构化访谈，了解前24小时内药物使用、睡眠和体育活动情况，以及禁食状态、近期病毒或细菌感染和吸烟状况（当前、过去和从未）。此外，所有参与者在首次采样日记录基线半结构化访谈，包括基本人口学信息和临床特征。CH患者的诊断由医师（A.S., A.S.P., R.J.）或 specially trained 医学生（A.F.P.）验证。

所有参与者在发作间期采样。血液采集到标准EDTA抗凝管中并多次颠倒。室温静置30分钟后，样品在4°C下以1409 g离心10分钟。将1 mL血浆转移至冻存管（Greiner Bio-one），先保存在-25°C，然后转移至-80°C永久保存待分析。使用定制开发的 sandwich-电化学发光免疫分析法（Electrochemiluminescence Immunoassays）测量PACAP-38和CGRP的血浆水平。 assays 在操作实验室（Celerion, Switzerland）内部验证。开发了一种 assay，使用MSD S-PLEX技术定量测定人EDTA血浆中的PACAP-38水平。该 assay 基于灵北制药（Lundbeck）专有抗体，以合成PACAP-38（Bachem, 4031157）作为校准品。 assay 的分析范围从50至80,000 fg/mL，定量下限（LLOQ）设定为50 fg/mL。使用四参数逻辑（4PL）回归模型（1/y²加权）插值未知值。样品在同一运行中重复分析，并根据相应稀释因子调整。人EDTA血浆样品中CGRP的 quantification 使用CGRP MSD S-PLEX assay 评估。该 assay 同样基于灵北制药专有抗体，以合成人α-CGRP（Bachem, 4013281）作为校准品。分析范围从200至80,000 fg/mL，LLOQ设定为200 fg/mL。使用4PL回归模型（1/y²加权）插值未知值。在 assay 过程中，样品在含蛋白酶抑制剂溶液的 assay 缓冲液中稀释8倍后，在同一运行中重复分析。所有血浆水平结果以 pg/mL 报告。

主要结局是组间（cCH、eCH发作期、eCH缓解期、HC）PACAP-38血浆水平的差异，调整性别、年龄、共病偏头痛和前24小时内发作频率。其次评估组间CGRP血浆水平的差异（调整相同参数），以及PACAP-38和CGRP血浆水平之间是否存在相关性。参与者通过人口学特征（生物性别、年龄、CH首发年份、共病、通常发作持续时间（分钟）和通常每日发作负担）和采样日前24小时内的临床特征进行描述：当前头痛、前24小时或前一周内是否有CH发作、最后一次发作使用中止药物（曲普坦或氧气）、使用预防性药物（维拉帕米或其他）、采样时间、采样季节（冬、春、夏、秋）、前晚睡眠时长（<6、6–8、>8小时）、前24小时内锻炼、前一周内感染（病毒或细菌）和头部创伤（前一个月内）。

生物库的样本量已在已发表研究中确定。纳入过程的流程图见图1，详细描述可参考。测量后，一个样本因溶血被排除，一个因体积不足被排除。另外四个样本因30天内使用类固醇治疗共病（eCH发作期n=1，eCH缓解期n=2）或CH口服过渡治疗（eCH缓解期n=1）被排除。另外14个样本因技术原因被丢弃（cCH=2，eCH发作期=6，eCH缓解期=6）。分析后，一个CGRP血浆水平超出验证范围的样本被排除。为去除可能 influential 和错误异常值，排除血浆水平超过中位数七倍IQR的样本（cCH n=4, eCH发作期 n=1, eCH缓解期 n=2, HC n=3）。血浆水平低于可量化范围（PACAP-38 <0.05 pg/mL, n=18; CGRP <0.2 pg/mL, n=1）的样本在四研究组中分布不均，可能反映系统趋势，分别以0.049 pg/mL（PACAP-38）和0.199 pg/mL（CGRP）值纳入分析。为基于尽可能多样本得到结果，允许未配对样本纳入未配对分析。

所有数据管理和统计分析使用SAS统计软件9.4版（SAS Institute Inc., NC, USA）和R软件4.3.0版（R Foundation, Vienna, Austria）进行。数值描述性数据以均值±标准差（SD）或中位数（四分位距, IQR）适当呈现。分类变量以计数和百分比呈现。通过直方图和QQ图评估各患者组数据的正态分布。对于PACAP-38和CGRP的组间比较，正态分布数据使用配对和未配对t检验，非正态分布数据使用Wilcoxon符号秩检验（配对数据）和Wilcoxon-Mann-Whitney检验（未配对数据）。为确定发作期和缓解期CGRP的可能相关性，应用Pearson秩检验。调整多重比较，结局p值使用错误发现率法校正。为确定基线协变量对PACAP-38和CGRP水平的影响，使用两个模型：以PACAP-38为结局的广义线性混合模型，假设伽马分布和对数连接函数；以CGRP对数转换为结局的线性混合模型。所有模型假设合理满足。使用散点图（LOESS平滑）和Spearman相关评估人群水平和组水平PACAP-38和CGRP水平之间的关联。缺失数据患者从 examined 变量分析中省略，并在表中报告。所有检验接受5%显著性水平（p<0.05，双尾）。所有发现根据STROBE指南报告。

研究结果

总共筛查310例CH患者，其中211例符合条件参与者。相应地，纳入101例HC。经筛选，392份样本纳入分析，来自99例cCH患者、106例eCH患者（103例缓解期，106例发作期，因此总103对完整配对）和101例HC。纳入参与者的人口学和临床特征见表1。eCH和HC之间匹配成功。采样日临床变量汇总见表2。

在所有CH状态（cCH、eCH发作期和eCH缓解期）中，与HC相比，均鉴定出PACAP-38水平升高（p=<0.0001–0.003）（表3，图2）。广义混合模型提供疾病组与HC之间差异的参数估计。显示 collectively 所有CH患者平均PACAP-38水平比HC高34.3%（95% CI: 20.1%–48.6%, p<0.0001），调整性别、年龄、共病发作性偏头痛和前24小时内发作频率。按亚组，cCH显示最大差异，比HC高49.8%（95% CI: 26.7–77.2, p<0.0001），而eCH发作期和eCH缓解期分别显示高39.5%（95% CI: 18.8–63.8, p<0.0001）和34.1%（95% CI: 14.2–57.5, p=0.0005）血浆水平。比较三种疾病状态内PACAP-38水平，数值上但无统计学差异（p=0.2–0.3），均值±SD值分别为cCH 0.18±0.13 pg/mL、eCH发作期 0.16±0.12 pg/mL、eCH缓解期 0.15±0.1 pg/mL（表3，图2）。广义混合模型显示性别（p=0.68）、年龄（p=0.10）、共病发作性偏头痛（p=0.07）或前24小时内发作频率（p=0.77）对估计无影响。

未鉴定出CGRP血浆水平在HC与cCH、eCH发作期或eCH缓解期之间存在任何差异（p=0.2–0.8）（表3，图S1）。比较三种疾病状态内CGRP水平，未显示cCH与eCH发作期（p=0.11）和eCH缓解期（p=0.84）之间存在任何差异。eCH发作期与eCH缓解期血浆水平配对比较也未检测到明显差异（p=0.09）。尽管如此，数值上，血浆水平显示缓解期CGRP水平较发作期上升，经Pearson相关确认（r=0.52, p<0.0001）。在线性混合模型中，CGRP水平不受性别（p=0.07）、偏头痛共病（p=0.12）和前24小时内发作频率（p=0.75）影响。仅年龄显示影响，每增加一岁与CGRP水平增加0.79%相关（95% CI: 0.50%–1.08%, p<0.001）。

PACAP-38和CGRP血浆水平未显示相关性，既不在整个人群水平（Spearman相关; r=0.08, p=0.10），也不在各组内（Spearman相关; eCH缓解期; r=0.05, p=0.59, eCH发作期; r=0.15, p=0.12, cCH; r=?0.002, p=0.99, HC; r=0.10, p=0.32）（图3）。

讨论与结论

本研究 presents CH中系统性PACAP-38血浆水平的大规模评估，显示所有三种疾病状态与HC相比均显著升高。与HC相比，cCH中PACAP-38水平升高近50%，其次是eCH发作期36%和eCH缓解期34%。未鉴定出CGRP血浆水平的此类差异。最后，未鉴定出CGRP和PACAP-38水平的明显相关性。

确认初始假设，PACAP-38在所有CH疾病阶段与HC相比显示水平升高。此目标仅在两项 prior 研究中探索过。第一项研究报告eCH缓解期PACAP-38水平低于HC，eCH参与者发作期水平高于缓解期。另一项研究报告eCH发作期水平高于cCH，但与HC水平无差异。因此，两项研究 present 与我们的发现不一致的发现，可能由样本量小得多（分别n=9和n=31）解释。后一项研究中仅使用历史对照组构成我们前瞻性大规模研究提供CH中PACAP-38水平更确定估计的额外论据。我们的发现与偏头痛患者中报告的PACAP-38水平升高一致，支持PACAP-38作为偏头痛和CH病理的共同核心参与者。

CH既定病理生理的一部分是CH发作期间血管舒张神经肽（包括PACAP-38）的释放，继发于三叉神经血管通路的激活。一致地，人们会预期CH患者与HC相比PACAP-38水平升高，如我们的结果所证明。此外，我们假设水平随发作活动增加而增加。虽然采样前24小时内发作频率不影响PACAP-38水平，但我们发现cCH人群PACAP-38水平最高，他们经常但非排他性地遭受CH疾病组中最持续的发作活动。 Collectively，这可能表明规律而非近期发作活动诱导PACAP-38水平升高。此外，我们推测发作活动周期外，例如缓解期，PACAP-38水平会降低。虽然未显示统计学显著差异，但我们发现eCH缓解期血浆水平数值上低于eCH发作期和cCH。我们建议此模式可能代表所有CH患者中潜伏升高的PACAP-38水平，包括缓解期，永久降低与HC相比激活三叉神经血管通路和三叉自主反射的阈值。加上 prior 观察PACAP-38输注诱导CH发作和靶向治疗在偏头痛中显示有希望的效果，这些发现建立PACAP-38作为CH可能治疗靶点的希望。我们认识到某些方面挑战PACAP-38在偏头痛中 implication 直接可转移性到CH：第一，偏头痛中既往研究包含发作期测量，而我们在cCH和eCH中的采样是发作间期。可能PACAP-38水平受发作活动调制，如Tuka等人先前证明的发作期血浆水平升高所暗示。第二，偏头痛患者与健康对照组相比PACAP-38血浆水平的差异大于我们的发现。第三，PACAP-38的诱发研究显示偏头痛中发作诱导率高于CH。尽管存在这些差异，本研究证实PACAP-38失调作为偏头痛和CH共享的病理生理特征，因此是明显的、可追求的治疗靶点。相应地，偏头痛和CH中其他共享病理生理参与者，如血管活性肠肽、细胞内机制和离子通道，构成潜在靶向的额外有趣前景。

至今，研究反复显示CGRP水平巨大方差，因此必须被认为是不稳定生物标志物。可能解释 decidedly 不一致结果的解释已被彻底辩论，突出样本来源、采样位置和样本解冻周期作为 contributing 因素。此外，使用不同 assays 用于CGRP测量及其对α-或β-异构体的特异性导致高度异质、 bordering 不可比较的估计。最后，建议的CGRP水平对超过6个月 prolonged 储存的敏感性增加单独研究不可比性。

我们的研究鉴定CH患者与HC之间CGRP水平相似，无论疾病状态。四项已发表研究先前比较了CH患者与HC的CGRP血浆水平，所有结果存在分歧。最感兴趣的是与Petersen等人最新发表研究结果的比较；一项对我们完全相同研究队列中CGRP水平的研究，源自丹麦丛集性头痛生物库。 present 所有三种疾病状态中CGRP水平降低与HC相比，这些结果与本研究的不同，尽管收集的血浆材料来自完全相同的队列。差异的可能原因包括当前研究的较长样本储存和使用具有高度可变敏感性的不同 assays，构成激烈辩论的主题。尽管如此，我们发现同一队列内分歧结果成为CGRP深刻不稳定、不适合CH生物标志物的明显论据，可能部分解释 prior CGRP mAbs试验中的有限治疗效果。

我们的任何分析未表明PACAP-38和CGRP血浆水平之间存在明显关系，既不在人群水平也不在各诊断组内，反驳我们初始假设。缺乏相关性可能归因于CGRP测量，基于可能 subjected 不确定性的 assay。因此，缺乏相关性应谨慎解释。无 prior 研究执行相关性评估；因此，在类似研究设置中重现以确认这两种重要神经肽之间是否真的无相互作用是可取的。

Collectively，我们的发现给出两种肽无同步模式的印象。从病理生理角度，PACAP-38和CGRP通路确实是两个独立实体，具有独立受体和分子向下级联，尽管它们 identical 最终效果：血管舒张。因此，可能两个系统在CH患者中独立或不平等激活，解释与CGRP水平相比PACAP-38更显著升高。另一个 plausible 解释是CGRP作为疼痛功能释放而非原因的理论。这将解释为什么仅发作期或发作后立即采集的样本一致显示CGRP水平升高。相反，我们的发作间期样本材料表明CH个体中 continuously 升高PACAP-38水平，建议升高PACAP-38作为基本病理生理功能障碍和CH病理的 causative 贡献者。

本研究在大样本CH患者中调查PACAP-38。方法学优势是彻底选择的临床良好表征参与者队列和系统收集、处理、储存和分析样本。局限性是，第一，从 tertiary 头痛中心招募参与者不可避免的选择偏倚。第二，我们的CGRP-assay选择构成可能局限性，由于建议的 assay 敏感性方差。无 prior 文献记录PACAP-38 assays 的相同方差，但这不能排除。第三，出于伦理考虑允许患者使用预防性和中止性药物，并允许除CH外的发作性头痛，可能影响两种神经肽的测量血浆水平。第四，本研究仅包含发作间期采样 due to可行性；因此，发作期PACAP-38水平和随时间变化的证明仍然是理想的研究前景。此外，纳入阳性对照组，即具有另一种慢性头痛疾病的队列，例如慢性偏头痛或新每日持续性头痛，可能有助于确定PACAP-38升高是否可能与一般慢性头痛状态而非CH特定相关。

总之，这项前瞻性研究 present CH患者PACAP-38血浆水平的大规模评估。发现所有三种CH疾病状态中PACAP-38血浆水平与无头痛对照组相比升高，为这个 profoundly 负担患者群体未来可能对PACAP-38靶向治疗的反应持有希望。