土壤原生生物（Colpoda sp.）协同增效农药种子处理剂传输：提升氯虫苯甲酰胺与多杀菌素对草地贪夜蛾防治效能的机制与应用前景

　　本研究创新性地发现土壤纤毛虫（Colpoda sp. UC-1）可作为天然载体增强农药（Chlorantraniliprole/Spinosad）在土壤中的传输效能。通过大规模温室实验证实，原生生物协同处理使玉米叶片被害率显著降低（p<0.001），为改善疏水性农药（log KOW>3）的根际传输提供了新型生物解决方案，对可持续农业与病虫害综合治理（IPM）具有重要实践价值。

　　

引言

化学农药包括除草剂、杀菌剂、杀虫剂和杀线虫剂在现代农业中广泛应用。虽然除草剂通常通过叶面喷施，但许多杀虫剂、杀菌剂和杀线虫剂需要土壤施用，通过水介质在土壤中传输后被根系吸收或发挥作用。某些农药因化学性质导致水基土壤传输性能较差，限制了其作为传统种子处理剂的应用。氯虫苯甲酰胺（Chlorantraniliprole）和多杀菌素（Spinosad）正是两种具有较差水基土壤传输性能的农药。

土壤原生生物是土壤微生物群落的重要组成部分。某些土壤原生生物已被证明能够促进悬浮颗粒和细菌在土壤及类土壤结构中的传输和靶向输送。本研究通过植物损伤实验，以玉米（Zea mays L.）和草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）为模型，比较了仅接种原生生物、仅使用农药以及农药+原生生物复合处理后的害虫取食损伤和死亡率。

材料与方法

实验设计包含生长阶段和害虫阶段两个部分。在生长阶段，玉米种子分别用六种含有细菌、原生生物和/或农药的混合物进行处理。所有处理均包含热灭活细菌（原生生物的食物源），额外添加成分包括两种农药中的一种，或土壤原生生物，或一种农药+土壤原生生物。

原生生物鉴定为纤毛虫属Colpoda（分类为UC-1），使用热灭活的大肠杆菌DH5α进行培养和传代。草地贪夜蛾幼虫选择二龄期，玉米品种为商业杂交种Prairie Hybrids 3773。土壤使用Coloma壤质沙土（源自密歇根州），经干燥和巴氏消毒后使用。

农药选择基于以下标准：具有植物韧皮部或木质部运输能力，表现出全身性效益，土壤半衰期长（>50天），以及物化性质适合。氯虫苯甲酰胺和多杀菌素均满足这些标准，且对UC-1培养物无操作毒性。

种子处理配方在种植前24小时制备，每粒种子接种50μL配方溶液。生长阶段在温室中进行，土壤填充盆栽，随机排列。10天后生长阶段结束，从每株植物收获第3叶，再经过4天（总生长14天）后收获第4和第5叶。每片叶分为远端3.8厘米段（尖端）和中部3.8厘米段。

害虫阶段将叶段置于16孔板中，每孔加入5mL 0.8%琼脂维持湿度，并接入一头二龄草地贪夜蛾幼虫。密封培养4天后评估取食损伤和幼虫死亡率。

结果

整体农药保护效果

整体取食损伤是通过对每株植物的六个叶段损伤取平均值计算的。基线处理和仅原生生物处理之间无显著差异（94% vs 95%取食损伤，p>0.10）。氯虫苯甲酰胺处理和多杀菌素处理均表现出显著低于基线或仅原生生物处理的平均取食损伤（分别为62%和53%，p<0.001）。原生生物与每种农药的共同接种进一步减少了取食损伤（p<0.001）。氯虫苯甲酰胺+原生生物的平均取食损伤为53%，多杀菌素+原生生物为32%。

氯虫苯甲酰胺按叶段保护效果

在所有情况下，氯虫苯甲酰胺+原生生物处理的取食损伤显著低于基线或仅原生生物处理（p<0.001）。不加原生生物的氯虫苯甲酰胺效果因叶位而异，早期叶片比后期叶片得到更好保护。与基线和仅原生生物处理相比，氯虫苯甲酰胺在第3叶的两个段以及第4叶尖端和第5叶尖端显著减少取食损伤（p<0.001），其余两个段（第4叶中部、第5叶中部）显示无或仅边际显著减少（p≥0.050）。

比较氯虫苯甲酰胺与氯虫苯甲酰胺+原生生物处理的取食损伤，结果再次因叶位而异。氯虫苯甲酰胺+原生生物相对于氯虫苯甲酰胺显著减少第4叶尖端（49% vs 38%，p=0.013）、第4叶中部（86% vs 65%，p<0.001）和第5叶中部（88% vs 64%，p<0.001）的取食损伤。原生生物的共同接种对第3叶的两个段或第5叶尖端没有额外的保护作用（p>0.050）。重要的是，在氯虫苯甲酰胺单独处理未能显著减少取食损伤的两个段（第4叶中部和第5叶中部），原生生物的共同接种显著减少了取食损伤。

多杀菌素按叶段保护效果

对于多杀菌素处理，按叶段划分的取食损伤显示出与整体取食损伤相同的趋势。在几乎所有情况下，多杀菌素显示出极显著低于基线或仅原生生物处理的取食损伤（p<0.001），除第5叶中部外（与仅原生生物相比p=0.014，与基线相比p=0.053）。与氯虫苯甲酰胺不同，多杀菌素单独处理与多杀菌素+原生生物在每个叶段上存在统计学显著差异（p<0.001）。

由于多杀菌素即使不共同接种原生生物也比氯虫苯甲酰胺更有效，添加原生生物的相对效果不如氯虫苯甲酰胺明显。第4叶尖端从多杀菌素单独处理中看到的取食损伤最低，相对于基线减少58.5个百分点（93.5% vs 35.0%）。多杀菌素+原生生物导致75.8个百分点减少（至17.7%），即取食减少比多杀菌素单独提高30%。对于多杀菌素单独效果最差的第5叶中部，多杀菌素相对于基线减少取食损伤9.4个百分点（91.6% vs 82.2%），而多杀菌素+原生生物导致减少三倍以上，达31.3个百分点（至60.3%）。

讨论

根据本文描述的实验收集的取食损伤数据，我们得出结论，添加原生生物载体到氯虫苯甲酰胺或多杀菌素的种子处理中，在给定施用率下改善了保护效果，并延长了杀虫剂保护发育中植物的持续时间。

农药在土壤中的吸收与孔隙水中农药浓度正相关，而水主要被玉米的侧根吸收。因此，为了维持农药性能，生长根周围的孔隙水中必须存在一定的有效浓度。对于本研究中选择的这类水溶性差且相对疏水的化合物，我们可以预期大部分种子处理将保持为制剂颗粒固体而非溶解在孔隙水中。此外，在没有原生生物存在的基础情况下，大部分颗粒将保持在最初种子处理时放置在土壤中的位置附近。

在我们先前的工作中，我们直接观察到原生生物通过几种不同机制移动颗粒（荧光微球和荧光细菌）。因此，在本研究中，我们假设原生生物载体可以将氯虫苯甲酰胺和/或多杀菌素颗粒沿生长根运输，并且运输颗粒中包含的杀虫剂可以分配或溶解到更远端孔隙空间的孔隙水中，从而扩大土壤中杀虫剂浓度高于其有效浓度的区域。随后不断扩展（通过原生生物载体）的杀虫剂“羽流”被生长根吸收，将导致可观察到的害虫保护差异，即杀虫剂+原生生物处理与仅接受杀虫剂的处理相比。

玉米根在前3周迅速生长和扩展。玉米幼苗以完全展开叶的数量为特征，我们重点关注具有三片（V3）、四片（V4）和五片（V5）叶的幼苗。在玉米中，可以将叶期与根网络的大小关联起来。玉米根干重在V3和V4之间大约翻倍，在V4和V5之间再次翻倍，尽管仅过去了4天。在我们的实验中，第4和第5叶在同一时间（第14天）收获；因此，我们必须记住第4叶先发育，当时植株具有较小的根网络。没有载体时，更多V5叶系统采样的远端孔隙空间将不包含杀虫剂，或杀虫剂浓度低于有效浓度，因此我们应该在仅杀虫剂处理中看到第5叶（即V5，具有更广泛根系统）的保护作用减弱 versus 第4叶（即V4，具有更紧凑根系统）。最后，作为禾本科植物，玉米叶从基部延伸，叶尖先发育。因此，第5叶中部是我们采样的段中最后发育的，它发育时植株具有最大的根系统，从最大面积吸收水分。如果存在原生生物载体可以解决的传输限制，我们预计虫害保护从第3叶到第4叶再到第5叶递减，从尖端到中部递减，并且在每种情况下，杀虫剂处理与原生生物载体共同接种的虫害减轻（即更大保护）。

对于测试的两种农药，氯虫苯甲酰胺和多杀菌素，第5叶中部段显示最少的保护（最大取食损伤），并且在两种情况下，仅化学处理与对照无统计学差异。我们可以想象，在这些情况下，玉米根系统扩展到了孔隙水杀虫剂浓度低于某些有效浓度的区域。然而，通过添加原生生物载体，我们看到对于两种杀虫剂，在第5叶中部段与仅杀虫剂处理相比，叶片损伤显著减少（>20%）且具有统计学意义（p<0.001）。原生生物运输农药颗粒（无论是内部、通过表面附着、通过产生流动，还是通过其他机制）沿生长根的拟议机制与这些观察结果完全一致。

与农药种子处理共同接种原生生物可以在给定剂量下增强性能，减少植物内吸性种子施用农药所需的治疗剂量，和/或延长施用杀虫剂的保护时间（通过随着根扩展而扩散杀虫剂“羽流”）。这些有益效果可能尤其在水辛醇分配系数低（即水溶性差或疏水）的农药中观察到。例如，以标签速率（0.25–0.75 mg per maize seed——比此处使用的剂量高500-1500倍）作为种子处理的氯虫苯甲酰胺，在出苗后约30天对草地贪夜蛾的保护明显下降。与此同时，玉米植株的草地贪夜蛾侵扰通常发生在出苗后第10-45天，当种子处理的初始保护减弱或植株生长超过保护区域时，可能需要后续处理。与土壤原生生物共同接种，已被证明通过多种机制运输颗粒，可以沿根系统扩散固体聚集体，扩大初始处理所服务的空间区域，包括后期出现根将生长的土壤区域。

减少施用率或减少再施用的需要可以降低杀虫剂处理成本，减少不利环境影响，并帮助种植者在监管限制内实现所需性能。然而，据我们所知，目前尚无商业化的接种剂含有有益原生生物，因此基于原生生物的共接种剂的相关经济成本和效益未知。也就是说，除了载体效应外，修正土壤原生生物还有许多好处，这可能进一步增加原生生物共接种剂的经济效益。重新建立可能因施肥而耗竭的原生生物的好处可能包括：（i）通过自上而下的选择性放牧调节细菌功能（即促进植物有益细菌和减少病原细菌）；（ii）通过营养循环调节土壤肥力；（iii）减少土壤细菌群落中的抗生素耐药性。

结合我们之前的工作，我们认为本研究中的原生生物很可能是执行了 facilitated transport 或“载体”功能。然而，其他机制也是可能的，并可能导致杀虫剂与原生生物结合时性能增强。例如，本研究测试的原生生物可能部分代谢了农药，或通过其他机制使农药更易被根吸收。然而，这种机制无法解释观察到的保护程度（第3叶 > 第4叶 > 第5叶 和 尖端 > 中部）与叶段出现时根系统的空间范围完全一致。

本研究描述的实验是在其源地点（密歇根州）经过干燥和巴氏消毒的土壤中进行的，以便运输到印第安纳州的Corteva设施。尽管本实验中使用的土壤是真实的、完整的土壤，并且不是无菌的，但土壤微生物群落（包括细菌、真菌、原生生物和多细胞生物）的组成和丰度肯定发生了改变，并且与土壤最初在田间采集时相比很可能减少了。很难预测原生生物对农药的传输在“活”的农业土壤中会有何不同。原生土壤的某些方面，如良好的团聚土壤结构，可能将原生生物集中在生长根附近，从而增加效果，而营养相互作用可能增加或减少修正后的原生生物种群。需要使用未巴氏消毒的土壤进行额外的温室研究和全规模田间试验来解决这些问题。

虽然还有其他研究检查作物对农药的吸收，但它们通常专注于农药发现：通过将吸收与化学性质关联，或一般性检查吸收发生的方式。有些专注于修改农药制剂，这通常导致与种子处理不兼容的施用方法，或与本文提出的技术无关。一种有趣的方法专注于通过共同接种种子与植物生长促进根际细菌来增强作物农药吸收，这种方法可能与本文提出的方法完全兼容甚至协同。

本研究使用的原生生物最初从沙壤土中分离出来，它们利用颗粒间的水膜游动。根据另一项研究的结果，原生生物 facilitated transport 可能在更沙性或更干燥的土壤中更有效。随着土壤变干，水首先从聚集体间大孔隙排出，然后从整体土壤中排出，但即使在整体土壤完全干燥的情况下，水也可以保留在生长植物附近（即根际）。土壤原生生物依靠水力连接的孔隙空间在土壤中移动。土壤饱和度降低将限制原生生物可及的土壤体积，并迫使一些原生生物保持紧邻水合植物根，可能放大载体效应，因为原生生物优先在紧邻植物根的水膜中排出的内化颗粒或脱落表面附着颗粒。

此外，本研究使用的原生生物最初从豆科植物根际分离，并先前已用于类似研究，运输共接种的植物生长促进根际细菌苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）沿苜蓿近亲蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的根。需要额外研究来确定UC-1或其他土壤原生生物在何种程度上可能增强其他“有效载荷”沿其他植物根，在其他土壤和其他条件下的运输。然而，UC-1在提供实质性、显著和稳健的保护玉米免受草地贪夜蛾虫害方面的多功能性，显示了该方法的普遍适用性的 promising 迹象。

结论

本研究报道了通过共同接种土壤原生生物，两种常用精选杀虫剂氯虫苯甲酰胺和多杀菌素的性能增强。增强的性能通过960株在完整、先前巴氏消毒土壤中生长的玉米幼苗收获的叶段被草地贪夜蛾取食损伤减少来量化。原生生物共同接种的有益效果具有高度统计学显著性，反映了添加原生生物后植株叶片损伤总体减少，氯虫苯甲酰胺从62%降至53%，多杀菌素从53%降至32%。结合我们之前的工作（通过内部捕获、表面附着和诱导流体流动直接可视化原生生物介导的颗粒传输），这项工作为两种常规种子施用杀虫剂 simply通过添加原生生物即可获得实质性、显著和稳健的性能增强提供了证据。未来工作需要测量在未巴氏消毒土壤中的田间效益以及其他应用，如原生生物 facilitated transport of plant growth-promoting rhizobacteria。与土壤原生生物共同接种可能提供一种低成本且可持续的策略来增强常规化学和生物农业添加剂的性能。