分子印迹聚合物-固相萃取技术在蔬菜样品中药物残留分析中的开发、优化与应用

　　本文开发并验证了一种分子印迹固相萃取（MISPE）结合高效液相色谱（HPLC）的分析方法，成功用于同时测定莴苣、胡萝卜、黄瓜和辣椒中萘普生（naproxen）、吉非罗齐（gemfibrozil）、非诺洛芬（fenoprofen）、布洛芬（ibuprofen）和双氯芬酸（diclofenac）五种药物残留，并系统评估了其健康风险。该方法回收率达45%–103%，相对标准偏差（%RSD）低于15%，为复杂植物基质中痕量药物分析提供了高选择性解决方案。

　　

1 引言

药物残留物在环境中的日益增多引起了对其在食物链（特别是可食用植物中）可能积累和富集的担忧。传统分析方法难以选择性分离和定量复杂植物基质中的痕量化学品。本研究引入了一种优化方法，通过分子印迹固相萃取（MISPE）技术结合高效液相色谱（HPLC）和光电二极管阵列检测器，对蔬菜中非诺洛芬、萘普生、双氯芬酸、布洛芬和吉非罗齐进行分析。该方法成功应用于南非德班市采集的莴苣、胡萝卜、黄瓜和辣椒样品。

药品经常被合成用于治疗疾病，但大量药物通过污水处理厂（WWTPs）进入环境，未能完全去除，最终进入污水污泥和流出物。这些药物主要来源于土地应用，包括动物粪便、污水生物固体和受污水处理厂影响的河流灌溉的作物。非甾体抗炎药（NSAIDs）和吉非罗齐作为脂质调节剂被广泛使用，这些药物在污水处理厂流出物、污泥和水源中被频繁检出。药物在土壤中的持久性和积累，以及剩余药物的不当处置，可能导致其浓度升高，对生物体构成潜在威胁。

在样品前处理方面，固相萃取（SPE）因其简单性和在分离化学中的重要作用而受到关注。分子印迹聚合物（MIPs）作为最有前景的SPE吸附剂之一，具有明显的选择性。MIPs是专门设计的聚合物材料，具有体现模板分子功能基团、大小和形状的空腔，因此具有独特的分子识别能力。分子印迹固相萃取（MISPE）在提取技术、光学异构体分离、传感器和分析应用中极具价值。此外，这些吸附剂的高结合能力有助于从多种基质中高效提取分析物。

考虑到食物是人类营养的主要来源，食品安全因人口快速增长和工业化成为全球严重的公共卫生问题。蔬菜中的药物残留可能带来多种健康影响，包括内分泌干扰、生殖问题、癌症风险增加以及可能的过敏反应或疾病。长期暴露于低水平这些污染物与这些问题相关，一些研究还提示前列腺癌、肺癌和肝癌风险增加。所选药物在南非（SA）广泛使用，预计在南非环境中存在高浓度。尽管近年来环境中这些药物的存在已有报道，但尚未有研究通过MISPE研究它们在蔬菜中的吸收。据我们所知，缺乏关于使用MIPs研究所选药物在蔬菜中吸收的发生或摄取以及进一步评估人类健康风险的已发表研究。此外，各种研究探索了MIPs的合成和使用，以选择性识别萘普生、布洛芬或双氯芬酸作为单一化合物。本研究旨在同时评估和检测生食蔬菜（如沙拉）中的萘普生、吉非罗齐、双氯芬酸、布洛芬和非诺洛芬。

2 材料与方法

2.1 试剂

双氯芬酸钠盐（99%）、萘普生（≥98%）、吉非罗齐（≥98%）、非诺洛芬（99%）、布洛芬（98%）以及HPLC级乙腈（99.7%）、丙酮（≥99.8%）、甲醇（≥99.8%）、二氯甲烷（≥99.8%）、2-乙烯基吡啶（99%）和1,1'-偶氮二（环己甲腈）（98%）购自德国Steinheim的Sigma-Aldrich。98%甲酸购自德国Steinheim的Fluka。

2.2 仪器

分析物分离在日本京都岛津公司的HPLC系统上进行。系统包括SPD-20A紫外/可见检测器、在线脱气单元（流动相：DGU-20A3）、LC-20AB泵和20μL样品环。流动相为乙腈：0.2%甲酸水溶液（60:40, v:v），流速1mL·min^?1。分离在C18 Kinetex柱（150mm×4.6mm×2.6μm，美国Phenomenex）上进行。检测波长：布洛芬和双氯芬酸为210nm，萘普生、吉非罗齐和非诺洛芬为230nm。SPE实验使用瑞士Fribourg的Pall Corporation真空泵。Strata-X cartridge购自德国Aschaffenburg的Phenomenex。离心机、旋转蒸发器、搅拌器、科学烘箱和超声波浴等设备均从指定供应商购买。

2.3 分子印迹聚合物的合成

MIP合成根据我们先前工作的修改方法进行制备、表征和优化。采用两步反应程序完成聚合物的本体聚合合成。第一阶段将所有模板（各0.1mmol）溶解在250mL圆底烧瓶中，加入54μL 2-乙烯基吡啶（2-VP）和乙腈/甲苯（1:3, v:v）混合物，室温搅拌30分钟。第二阶段加入100mg 1,1'-偶氮二（环己甲腈）作为自由基引发剂和4.77mL乙二醇二甲基丙烯酸酯。混合物用氮气吹扫10分钟，密封后在60°C油浴中搅拌16小时以引发聚合。初始聚合通常在60°C左右进行，以便形成足够数量的自由基，因为此过程中更高的温度会破坏胶体结构。为实现固体聚合物，聚合完成后将温度升至80°C并保持24小时。所得聚合物在80°C烘箱中干燥至恒重。使用过量功能单体相对于模板是分子印迹中的典型策略，特别是在非共价印迹技术中。这种方法促进了模板-单体组装体的形成，从而在聚合物中创建印迹空腔。

2.4 样品采集与前处理

蔬菜样品的可食用部分购自南非德班周边的果蔬露天市场，包括莴苣、胡萝卜、黄瓜和辣椒。这些蔬菜因富含矿物质、维生素和多种植物化学物质而受到全球消费者欢迎。所有样品在混合前用蒸馏水清洗，并在混合后立即分析。

2.4.1 样品提取

采用文献中的修改方法进行提取。实验上，将蔬菜样品混合后，向5g混合蔬菜样品中加入25mL甲醇，进一步搅拌溶液。 resulting混合物在环境温度下超声处理20分钟，并分别保持5、10、15和20分钟进行提取，以确定不同时间间隔的提取效率。样品随后以2500转/分钟离心30分钟。液体提取物保存在250mL圆底烧瓶中。重复提取，合并提取物，并使用旋转蒸发器蒸发至1mL。随后，每个样品用200mL去离子水稀释。最后，过滤并调节pH至4.0。

2.4.2 分子印迹固相萃取方法的优化

通过将空的聚丙烯单拟合（3cc）小柱安装到歧管上实现；小柱首先用溶剂冲洗。然后，将第一个聚丙烯滤片插入小柱底部，并装入40mg MIP颗粒；第二个滤片放置在顶部。填充的小柱首先用5mL甲醇调节，然后用5mL去离子水平衡。加载200mL蔬菜样品（pH 4.0），以1mL·min^?1的流速提取。小柱真空干燥30分钟，保留的化合物用10mL乙腈连续洗脱。提取物在40°C氮气下蒸发至干。所得残留物用1mL乙腈重构，并注入HPLC系统。

2.4.3 回收率研究

回收率百分比是指通过特定分析技术从样品中成功回收的分析物部分，通过从样品中回收的分析物总量除以初始分析物浓度，再乘以100计算。使用Strata-X空聚丙烯单拟合SPE小柱 containing MISPE分析所选蔬菜样品。药物回收百分比在蔬菜的可食用部分（胡萝卜的根、黄瓜的所有部分、辣椒的果实部分和莴苣的叶部分）上进行评估，这些部分先前在环境温度下加标了药物溶液混合物。这些实验旨在评估蔬菜中药物的回收百分比。每个实验进行三次平行，并确定每种蔬菜的回收率。

在MISPE分析中，提取时间、样品体积、溶剂选择和流速是提取过程中起关键作用的一些参数。通过采用5、10、15和20分钟提取时间的样品从蔬菜样品中提取分析物来确定时间对回收率的影响。通过提取加标5mg·kg^?1（pH 4.0）所选药物混合物的50、100、200和500mL蔬菜样品来研究样品体积对回收率的影响。通过采用1–10mL·min^?1的样品流速来确定洗脱流速对回收率的影响。此外，使用莴苣作为测试样品进行溶剂调节的影响研究，该样品加标了5mg·kg^?1的药物溶液浓度。然后使用公式确定每个时间间隔、样品体积、洗脱流速和调节溶剂的回收率百分比。

2.5 方法验证

使用分析方法测试了MISPE方法分析目标药物的分析性能。使用标准溶液和基质匹配校准器进行线性测试；本研究考虑了检测限（LOD）、定量限（LOQ）和回收率百分比等参数。精密度以相对标准偏差（%RSD）表示。通过使用莴苣作为选定样品，加标两个不同浓度水平（0.05和5mg·kg^?1），并在相同优化条件下进行分析来实现。每种情况分析三个重复。通过向莴苣样品中加标蔬菜基质中的药物标准溶液来评估方法的选择性。这很重要，因为多种化合物可能干扰所选化合物从蔬菜中的提取，主要是因为它们能够竞争结合位点或破坏提取过程。这些包括其他有机酸、植物代谢物、色素（如叶绿素和类胡萝卜素）、蛋白质、脂质甚至一些无机分子。由于缺乏无分析物植物样品，使用Mangosuthu科技大学实验室种植的莴苣叶片（5g）作为空白样品，这些样品定期用无分析物水灌溉。

2.5.1 线性、LOD和定量

使用基质匹配方法评估线性，加标莴苣水平范围从0.05到5mg·kg^?1。将每种分析物的峰面积与浓度作图，以确定线性方程和回归系数（R²）。对于每种分析物，使用LOQ和LOD评估优化后的MISPE方法定量蔬菜样品中所选药物的灵敏度。LOD分别通过以下公式计算：LOD = 3σ/S 和 LOQ = 10σ/S，其中σ代表响应的标准偏差，S代表每种分析物校准曲线的斜率。

2.6 健康风险评估

评估暴露于有害物质对生态系统和公共健康的潜在损害的一个重要标准是将样品中这些污染物的浓度与各种国家或国际公共组织设定的最大水平进行比较。为此建立了各种标准；此外，还评估了危害商（HQ）和健康指数（HI）以进行健康质量控制。例如，HI是一种工具，用于总结和量化健康的不同方面，提供单个值或一系列值来代表人群或个人的整体健康。该参数评估食品产品中每种目标化学物的影响。文献表明，这些指标可以通过以下公式计算：HQ = Ci / MRL 和 HI = ΣHQ，其中Ci代表样品中化合物的浓度（mg·kg^?1），而MRL代表最大残留限。使用以下公式评估与儿童和成人相关的健康风险评估（HRA），该公式是可接受每日摄入量（ADI，单位为mg·kg^?1）与估计每日摄入量（EDI）的比率：HRA = EDI / ADI。

使用以下公式计算每种蔬菜样品中每种目标化学物的EDI：EDI = (Cp × D) / bw，其中Cp是蔬菜中药物残留的浓度（mg·kg^?1）。D是非洲地区新鲜蔬菜的平均每日消费量，估计为38.8g·人^?1·天^?1；bw是平均体重，成人视为60kg，儿童视为15kg。

3 结果与讨论

3.1 MISPE的优化

3.1.1 样品体积对SPE回收率的影响

SPE中的样品体积是一个重要参数，需要仔细调整以获得可靠和精确的分析物回收率。了解样品体积对吸附剂能力和突破的影响对于开发和评估有效的SPE程序至关重要。所得结果如图所示。50和100mL的样品体积导致较低的回收率百分比，分别在25%–35%和29%–39%之间。低回收率百分比可能是因为大多数分析物尚未在吸附剂上分配。因此，对于200mL样品，获得了可接受的回收率，从80%到98%。因此，选择200mL样品体积作为最佳体积。对于500mL样品，获得的回收率在38%到54%之间。高样品体积（500mL）下回收率的下降表明样品突破体积已超过。其他地方，通过提取500和1000mL去离子水样品研究了恩曲他滨、替诺福韦、萘普生、双氯芬酸、布洛芬、依非韦伦和吉非罗齐。选择500mL样品体积作为最佳体积。当样品体积超过吸附剂容量时，分析物可能未经保留就通过小柱，导致突破和较低的回收率。这一概念与其他研究人员在其他地方观察到的相一致。

3.1.2 洗脱流速对MISPE回收率的影响

本质上，流速是SPE中的一个关键元素，必须精确管理以实现高效可靠的分析物提取。流速和分析物的保留能力都受到样品溶液通过SPE柱的流速的影响。为缩短分析时间，流速需要足够高。然而，它需要足够慢以进行有效的分析物保留。因此，优化总洗脱分析物量并保证精确分析结果取决于优化该流速。在本研究中，检查了1–10mL·min^?1的样品流速，结果如图所示。SPE样品渗透和洗脱在流速分析中至关重要，因为这影响目标分析物如何从小柱中保留和洗脱。结果表明，洗脱流速和回收率百分比成反比。这通常是预期的，因为设置慢流速会导致更多分析物从解吸的吸附剂中洗脱。尽管吉非罗齐和萘普生在5mL·min^?1流速下显示出良好结果（>80%），但布洛芬、非诺洛芬和双氯芬酸的回收率低于可接受限，分别为61%、60%和66%。因此，为实现所有化合物的可接受回收率（80%–110%，%RSD值<15），选择1mL·min^?1的洗脱流速。所有化合物在10mL·min^?1流速下的结果不令人满意（<80%）。

3.1.3 调节溶剂对MISPE回收率的影响

SPE中溶剂调节的效果对于有效的分析物收集和后续洗脱至关重要。调节可去除污染物并激活吸附剂，从而改善分析物相互作用并最终提高回收率。选择正确的调节溶剂对于提高SPE过程的效率至关重要。使用莴苣作为测试基质进行溶剂调节评估，该基质加标了5mg·kg^?1浓度的药物溶液。程序的初始阶段涉及调节阶段；将适当的溶剂引入SPE小柱以润湿吸附剂床，从而激活吸附功能基团并增强可用于分析物结合的表面积。调节阶段在SPE分析中至关重要，因为它影响化合物与SPE吸附剂之间的相互作用，从而影响回收分析物的产量。本研究使用乙腈、二氯甲烷和甲醇检查了调节溶剂的效果，鉴于它们在酸性药物提取中的广泛使用。使用了200mL的最佳样品体积。图显示，所有测试溶剂的