柚皮苷通过多通路协同调控抑制炎症、凋亡、氧化及铁死亡缓解LPS诱导的急性肝损伤的机制研究

　　本研究通过整合网络药理学与实验验证，系统揭示传统中药化橘红（ECG）通过协同抑制TLR4/MyD88炎症通路、调控Bax/Bcl2/CASP3凋亡轴、激活Nrf2抗氧化信号（NQO1、GCLC、GCLM）及修复GPX4/SLC7A11铁死亡通路，显著降低LPS诱导的急性肝损伤（ALI）模型小鼠血清AST/ALT水平（p<0.05–0.001），为天然产物多靶点治疗ALI提供创新策略。

　　

引言

急性肝损伤（ALI）是一种以快速肝细胞坏死、炎症和肝功能障碍为特征的危及生命的疾病，常见病因包括药物毒性（如对乙酰氨基酚过量）、病毒感染、代谢紊乱和脓毒症诱导的内毒素血症。其中，细菌脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁的关键成分，是全身炎症和器官损伤（包括ALI）的有效诱导剂。LPS激活库普弗细胞上的Toll样受体4（TLR4），触发促炎细胞因子（如TNFα、IL-6、IL-1β）、活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的释放，共同驱动肝细胞凋亡、铁死亡和坏死性炎症。尽管支持治疗有所进展，但ALI的当前治疗方法仍然有限，肝移植是终末期病例的唯一治疗选择。这强调了对针对多种致病途径同时最小化不良反应的新疗法的迫切需求。

天然产物因其多组分、多靶点的治疗特性而成为治疗复杂疾病的有希望的候选者。与传统合成药物通常作用于单一途径不同，天然化合物协同调节相互连接的生物网络，从而提供更广泛的疗效和较低的耐药风险。化橘红（ECG）源自柑橘（Citrus grandis）的果皮，历史上在传统中药中用于呼吸系统疾病，富含黄酮类化合物（如柚皮苷、新橙皮苷）和香豆素，据报道具有抗炎、抗氧化和抗铁死亡活性。最近的研究表明，它通过调节脂质代谢和铁稳态来缓解LPS诱导的肺损伤和非酒精性脂肪肝病（NAFLD）。然而，其在ALI中的机制，特别是在调节凋亡和铁死亡方面，仍未探索。

材料与方法

本研究采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Exactive MS）对ECG的化学成分进行表征。动物实验使用雄性C57BL/6J小鼠（8周龄，22–25克）建立LPS诱导的ALI小鼠模型。小鼠随机分为四组（每组n=5）：对照组（Ctr）、模型组（Mod）、ECG低剂量组（ECG-L，50 mg/kg/day）和ECG高剂量组（ECG-H，100 mg/kg/day）。LPS（5 mg/kg）腹腔注射诱导ALI，6小时后收集血清和肝组织进行分析。

血清AST和ALT水平使用商业试剂盒测量。肝组织进行H&E染色、免疫组织化学（检测CD68、GPX4）、免疫荧光（检测p-p65、CAS3、Bcl-2）和qPCR分析（检测IL-1β、IL-6、TNFα、Bcl2、Bax、Fth、Slc7a11、SOD2、β-Actin）。肝组织铁含量使用商业试剂盒测量，蛋白质印迹（Western blotting）分析相关蛋白表达。

网络药理学方面，从TCMSP数据库筛选ECG的活性成分（口服生物利用度OB≥30%，类药性DL≥0.18），并从多个数据库（DisGeNET、DrugBank、GeneCards等）获取脓毒症相关靶点。使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过DAVID数据库进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。分子 docking 验证活性成分与关键靶点的结合亲和力。

结果

ECG治疗显著降低LPS诱导的ALI小鼠血清AST和ALT水平（p<0.05–0.001），并减轻肝组织炎症和坏死。qPCR和Western blotting显示，ECG显著下调促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、TNFα），通过下调TLR4/MyD88通路相关蛋白表达抑制细胞炎症，通过增加Nrf2核转位和NQO1、GCLC、GCLM等基因表达抵消氧化应激，通过调节Bax/Bcl2/CASP3抑制凋亡，并通过标准化铁含量和GPX4/SLC7A11表达抑制铁死亡。

网络药理学识别出ECG与脓毒症的127个共同靶点，突出关键通路包括TNF、p53和IL-17信号。分子 docking 证实ECG衍生的黄酮类和香豆素与凋亡和炎症调节因子具有强结合亲和力（如柚皮苷与TP53：-13.23 kcal/mol）。

讨论

ECG通过协同抗炎、抗凋亡、抗氧化和抗铁死亡机制减轻LPS诱导的ALI，通过多靶点调节关键通路介导。这些发现强调了ECG作为ALI天然治疗候选物的潜力，因此值得进一步的临床探索。整合网络药理学和实验验证的方法为研究传统中药提供了系统生物学驱动的框架，弥合了整体中药原则与还原分子生物学之间的差距。

结论

ECG通过多通路协同调控，包括抑制TLR4/MyD88炎症通路、调节凋亡相关蛋白Bax/Bcl2/CASP3、激活Nrf2抗氧化信号以及修复GPX4/SLC7A11铁死亡通路，有效缓解LPS诱导的急性肝损伤。其多靶点作用机制为开发天然产物基于ALI治疗提供了理论基础和实验依据，具有重要的临床转化价值。