利用人华通胶间充质干细胞构建3D胶原脱细胞生物支架并诱导其向软骨细胞分化的研究

　　本研究创新性地利用人华通胶源间充质干细胞（hWJ-MSCs）构建三维胶原脱细胞生物支架，通过组织学染色（H&E）、DNA定量、扫描电镜（SEM）及拉曼光谱等多维度验证脱细胞效能，证实该支架能有效支持hWJ-MSCs的增殖及软骨向分化（COL2A1、ACAN、SPARC基因显著上调），为软骨缺损修复及骨关节炎（OA）治疗提供了新型无细胞生物材料平台。

　　

引言

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）作为最常见的关节炎类型，其特征是关节软骨细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的进行性减少，最终导致关节功能障碍。当前OA的治疗策略多以缓解症状为主，效果有限。尽管存在包括关节自修复刺激和人工关节置换在内的多种外科技术，但仍缺乏根治性手段。研究表明，滑膜关节组织（如半月板、滑膜和软骨下骨）的缺陷可能导致关节应力异常，进而引发关节软骨退变和OA发生。

干细胞疗法与再生医学方法在临床前模型中展现出修复关节软骨缺损的潜力。间充质干细胞（Mesenchymal Stem/Stromal Cells, MSCs）注射在早期临床试验中被证实可减轻疼痛并促进软骨修复。MSCs因其多向分化潜能（成骨、成脂、成软骨等）及分泌ECM和细胞外囊泡的能力，在组织修复中发挥关键作用。另一方面，支架在组织再生过程中扮演重要角色，它不仅支持细胞生长、增殖和分化，还有助于塑造新生组织的形态和特性。

支架材料可分为天然生物材料、合成材料及复合型材料。近年来，将ECM组分或脱细胞基质与合成支架结合的复合支架显示出更好的生物活性。特别是由MSCs产生的生物支架，因其良好的降解性、组织适应性和ECM仿生特性而备受关注。脱细胞ECM支架能保留生物活性分子（如基质大分子和生长因子），模拟天然ECM的微环境，从而调控干细胞行为。

材料与方法

人华通胶间充质干细胞的分离与鉴定

从10名足月剖宫产婴儿的脐带中采集华通胶组织，采用组织块贴壁法分离hWJ-MSCs。细胞在含10%胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素（100 μg/mL）和1% L-谷氨酰胺的α-MEM培养基中培养，14天后获得原代细胞。流式细胞术鉴定细胞表面标志物（CD90、CD73阳性率＞95%，CD34、CD144阴性），并通过成骨（Alizarin Red S染色）和成脂（Oil Red O染色）诱导分化验证其多向分化潜能。

3D生物支架的制备与脱细胞处理

将hWJ-MSCs（7×10⁵ cells/mL）接种于1 mg/mL的Ⅰ型胶原凝胶中，聚合后培养21天。采用1%十二烷基醚硫酸钠（SLES）处理48小时，辅以DNase I和Triton X-100处理，彻底去除细胞成分。通过组织学染色（H&E、Alcian blue、Masson trichrome）、DNA定量、扫描电镜（SEM）和拉曼光谱（CRM）评估脱细胞效果。

支架再细胞化与软骨向分化

将hWJ-MSCs（2×10⁴ cells）接种于脱细胞支架，在成软骨诱导培养基中培养21天。通过Safranin O和Alcian blue染色检测糖胺聚糖（GAGs）沉积，免疫组化检测Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖（aggrecan）和骨连接蛋白（osteonectin）表达，qRT-PCR分析COL2A1、ACAN、SPARC基因表达。

结果

hWJ-MSCs的特性与多向分化能力

流式细胞术确认hWJ-MSCs高表达CD90（96.1%）和CD73（98.4%），低表达CD34（6.58%）和CD144（5.24%）。成骨和成脂诱导分化后，分别通过Alizarin Red S和Oil Red O染色验证钙结节和脂滴形成。

3D支架的细胞相容性与脱细胞效能

MTT实验显示hWJ-MSCs在胶原支架中增殖活性显著高于二维培养（p < 0.0001）。脱细胞后支架DNA含量降至70.21±7.62 ng/mg（原为1253.22±56.34 ng/mg，p < 0.0001），H&E染色未见细胞核残留，SEM显示支架孔隙结构完整，拉曼光谱证实碳水化合物、脂质和DNA含量显著降低。Alcian blue和Masson trichrome染色提示GAGs和胶原纤维得以保留。

软骨向分化效果

成软骨诱导21天后，Safranin O和Alcian blue染色显示GAGs大量沉积。免疫组化显示实验组Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和骨连接蛋白表达显著高于对照组（p < 0.0001）。qRT-PCR证实COL2A1、ACAN、SPARC基因表达显著上调（p < 0.001）。

讨论

本研究成功构建了hWJ-MSCs来源的3D胶原脱细胞支架，并证实其能有效促进软骨向分化。支架的双重组成（Ⅰ型胶原提供力学支撑，MSCs来源ECM提供生物活性信号）模拟了天然软骨微环境。脱细胞过程在去除细胞成分的同时保留了关键ECM组分（GAGs、胶原），为细胞附着、增殖和分化提供了理想平台。该策略为软骨组织工程提供了新型无细胞生物材料，具有重要的转化潜力。

结论

hWJ-MSCs来源的3D胶原脱细胞支架能有效支持软骨向分化，是研究ECM微环境调控细胞命运的理想模型，也为开发基于脱细胞ECM的再生医学产品奠定了基础。

伦理声明

研究经设拉子大学医学伦理委员会批准（IR.SUMS.REC.9367.7306），所有样本采集均获得知情同意。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢设拉子大学医学科学院干细胞技术研究中心的支持（基金号93-01-67-7768）。