基于One-Tip技术的高通量蛋白质组溶解度改变(PISA)方法实现低细胞输入的药物靶点鉴定研究

　　本研究针对传统基于质谱的细胞热转移分析(CETSA)方法在通量、自动化及样本需求量方面的局限性，开发了一种将蛋白质组整体溶解度改变(PISA)分析与One-Tip样品制备技术相结合的新方法。通过使用质谱兼容的去垢剂n-Dodecyl-β-D-Maltoside(DDM)进行细胞裂解，该方法将细胞需求降低至200 cells/μL，显著提高了膜蛋白（尤其是激酶靶点）的回收率，并在96孔板格式中实现了12小时内从细胞处理到质谱进样的高通量分析，为药物靶点鉴定研究提供了更高效、经济的解决方案。

　　

在药物发现和靶点鉴定领域，科学家们一直致力于开发能够准确识别小分子药物与细胞内靶蛋白相互作用的技术。基于细胞热转移分析(CETSA)的方法，如热蛋白质组分析(TPP)和其高通量版本蛋白质组整体溶解度改变(PISA)，通过监测蛋白质在加热过程中的溶解度变化来揭示药物与靶点的结合情况。然而，这些方法面临着几个关键挑战：传统工作流程需要大量细胞样本，多步骤样品制备难以自动化，且对膜蛋白（尤其是激酶等重要药物靶点）的回收效率低。此外，常用的去垢剂如NP40与质谱不兼容，需要额外的去除步骤，增加了样品损失和变异性。

为了解决这些问题，来自哥本哈根大学和乌普萨拉大学的研究团队在《Communications Chemistry》上发表了一项创新研究，他们将PISA分析与One-Tip样品制备技术相结合，开发了一种称为One-Tip-PISA的新方法。该方法使用质谱兼容的去垢剂n-Dodecyl-β-D-Maltoside(DDM)进行细胞裂解，无需缓冲液交换即可直接进行蛋白质消化，大大简化了工作流程，降低了样本需求，并提高了重现性。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先建立了整合PISA热稳定分析和One-Tip处理的实验工作流程；使用质谱兼容去垢剂DDM优化细胞裂解条件；通过窄窗口数据非依赖采集(nDIA)技术在Orbitrap Astral质谱仪上进行高通量蛋白质组分析；并采用96孔板格式实现高通量筛选。研究使用了HeLa人宫颈癌细胞系和SCC-25人鳞状细胞癌细胞系作为模型系统。

Impact of DDM concentration on cell lysis in PISA

研究人员首先评估了DDM浓度对PISA分析的影响。他们用不同浓度的DDM(1.0%、0.6%和0.2%)处理经星形孢菌素(STS)或DMSO对照处理的HeLa细胞，发现使用DDM显著增加了回收的蛋白质和肽段数量，与PBS对照相比，蛋白质和肽段数量的p值分别达到0.00005和0.00004。虽然DDM提高了回收率，但不同浓度之间的差异不明显，表明超过一定阈值后，增加DDM浓度并不能成比例地增强回收效果。

DDM不仅增加了蛋白质和肽段的鉴定数量，还提高了样品重现性。使用基于深度学习的真核细胞亚细胞定位预测工具DeepLoc 2.0分析发现，在所有亚细胞组分中，DDM处理均显示出比PBS更高的蛋白质提取效率，特别是在细胞膜、内质网、溶酶体、液泡和线粒体中。单因素方差分析(ANOVA)证实了这些亚细胞组分中存在高度显著的差异(p<0.0001)，其中内质网(p=5.6×10^-14, F=1134)和线粒体(p=1.8×10^-12, F=599)的效果最为明显。

在0.2% DDM条件下，研究人员鉴定到22个激酶，而PBS条件下只有15个激酶达到显著性阈值(FC>1或<-1且调整p值<0.05)。特别值得注意的是，蛋白激酶C家族成员(PRKCE, PRKCD)仅在含DDM的裂解条件下被发现。膜相关激酶如EGFR, AXL, FYN, YES1, SRC和ROR2也仅在含DDM的裂解组分中被鉴定到。酪氨酸激酶如EGFR和SRC在STS处理后表现出显著的不稳定化，而其他膜蛋白激酶如AXL, PDGFRB和AAK1则在0.2% DDM组分中显示稳定化。

Evaluation of the cell concentration limit for One-Tip-PISA analysis

研究人员接下来评估了One-Tip-PISA方法的细胞浓度限制。他们将HeLa细胞用载体(DMSO)、5μM或10μM STS处理，并制备了800 cells/μL、600 cells/μL、400 cells/μL和200 cells/μL的细胞稀释液。Orbitrap Astral分析显示，在400 cells/μL和800 cells/μL条件下，蛋白质鉴定结果一致(~6200-6300个蛋白质组)，但在200 cells/μL条件下，蛋白质鉴定数量显著下降，肽段鉴定减少了超过25,000个。

比较800 cells/μL和200 cells/μL条件下的结果显示，在较高细胞浓度下可以清晰观察到STS与激酶如AURKA和PAK3的结合，而在较低浓度下，log2 FC和-log10调整p值显著减小，统计学显著的激酶数量大大减少。Spearman相关性分析显示，800 cells/μL与600和400 cells/μL之间的相关性分别为0.81和0.84，但与200 cells/μL的相关性在-0.62到-0.21之间，表明One-Tip-PISA方法的灵敏度极限在200 cells/μL左右。

主成分分析(PCA)进一步证实了200 cells/μL条件与其他细胞浓度条件的分离，表明该浓度下的分析可靠性较低。研究人员还在SCC25细胞中测试了One-Tip-PISA方法，使用非激酶抑制剂SHP-2抑制剂RMC4550，结果显示其直接靶点酪氨酸磷酸酶PTPN11(SHP-2)表现出清晰的浓度依赖性效应。

Comparison of One-Tip-PISA to PISA-PAC

研究人员比较了One-Tip-PISA与基于磁珠的蛋白质聚集捕获(PAC)方法。在所有细胞稀释度和处理条件下，One-Tip-PISA方法 consistently产生较小的变异系数(CV)值，表明更高的重现性。使用DeepLoc 2.0进行的亚细胞定位分析显示，200 cells/μL样品与其他组之间存在明显差异。

虽然PAC方法在800-600 cells/μL范围内比One-Tip-PISA方法鉴定到更多独特的激酶，但One-Tip-PISA显示出与PAC的强相关性(0.71-0.76)，并提供了更简化的工作流程和更高的通量。值得注意的是，对于某些样本类型，如癌症干细胞或新鲜分离的小鼠免疫细胞，细胞浓度通常较低，强调了对最小样本输入方法的需求。

High-throughput One-Tip-PISA approach on SCC25 cells with kinase and non-kinase inhibitors

为了展示One-Tip-PISA工作流程的高通量能力，研究人员采用了96孔板格式，测试了10种激酶抑制剂和一种酪氨酸磷酸酶抑制剂，共23种条件，每个条件4个重复。整个工作流程从药物处理到质谱进样在一天内完成。

分析结果显示，每个条件平均定量了6736到7091个蛋白质，所有条件的median CV值均低于0.25。热图分析显示了每种抑制剂的不同靶点谱，除厄洛替尼(Erlotinib)和SP600125外，所有处理都影响了激酶的热稳定性。特别值得注意的是，Wortmannin处理导致了PIK3CB和PIK3CA的浓度依赖性不稳定化，而不是稳定化，这可能是因为其结合诱导了激酶结构域环的构象变化。

研究人员还将One-Tip-PISA工作流程扩展到上皮样SCC25细胞，使用激酶和非激酶抑制剂进行处理。热图分析显示，变构SHP2抑制剂RMC4550显著稳定了其已知靶点PTPN11。内质网Ca²⁺-ATPase抑制剂Thapsigargin影响了其已知下游靶点c-fos蛋白和Transthyretin(TTR)的稳定性。亚细胞定位分析表明，One-Tip-PISA有效回收了广泛亚细胞定位的蛋白质，没有对特定区室的偏向。

研究结论表明，One-Tip-PISA方法是一种重现性好、流程简化且灵敏的热蛋白质组学方法，允许在96孔板格式中轻松处理完整细胞，从PISA分析到可处理数据只需2天时间。该方法允许处理低至400 cells/μL(相当于50,000个细胞)的有限样本量，在某些情况下甚至可达200 cells/μL。与已建立的基于PAC的PISA工作流程相比，One-Tip-PISA在检测激酶靶点方面表现出良好的一致性，但显示出更小的CV值，表明通过简化的工作流程可以实现更高的重现性。

该方法的进一步优势包括更高的通量，以及不需要特定的样品制备设备，这使得该方法更加经济实惠，对于预算较小且无法获得昂贵自动化设备(如液体处理机器人)的实验室更具吸引力。通过使用激酶和非激酶抑制剂组合，研究人员证明了该方法的高通量能力，在96孔板格式中处理24种不同样品条件，具有高分析深度和低样品变异性，强调了One-Tip-PISA的速度和易用性。

这项研究的重要意义在于它为药物靶点鉴定领域提供了一种更高效、更经济且更易操作的技术平台，特别适用于样本量有限的研究场景，如临床样本或珍贵细胞模型的研究。通过降低技术门槛和提高通量，One-Tip-PISA有潜力促进更广泛的实验室参与药物发现和靶点验证研究，推动个性化医疗和精准药物开发的发展。