新型宫颈胃型腺癌细胞系KGAS的建立及其在化疗耐药机制研究中的意义

　　本期推荐：为攻克宫颈胃型腺癌(GAS)化疗耐药难题，研究人员成功建立首个GAS来源细胞系KGAS及其耐药亚系rKGAS。通过STR分析、CDX小鼠模型及miRNA测序技术，证实该模型保留GAS典型标志物(Claudin-18/MUC6)并揭示17个差异miRNA调控BCL2/MET/SIRT1/VEGFA等靶点的耐药机制，为开发靶向疗法提供关键实验平台。

　　

宫颈癌作为全球女性第四大常见恶性肿瘤，每年导致约31万人死亡。虽然HPV疫苗接种使HPV依赖性宫颈癌发病率下降，但HPV非依赖性宫颈癌的占比正持续上升。其中胃型腺癌(Gastric-type adenocarcinoma, GAS)作为宫颈腺癌的罕见亚型，约占腺癌病例的10%，因其诊断困难、对标准化疗方案固有耐药及预后极差的特点，成为临床治疗的重大挑战。

GAS由Kojima等于2007年首次定义，其特征为细胞边界清晰、胞质丰富呈透明或淡嗜酸性。80%的GAS病例分化良好，使得常规细胞学和组织活检难以确诊。2020年WHO分类将其明确列为HPV非依赖性亚型。更严峻的是，GAS患者无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)显著低于普通型宫颈腺癌，而至今尚无GAS来源的细胞系模型，严重阻碍了其生物学特性研究和治疗策略开发。

面对这一空白，日本研究团队从一名42岁GAS复发患者的腹水中成功建立了首个GAS来源细胞系KGAS。该患者初诊为IIB期宫颈癌，接受根治性子宫切除术后5个月出现阴道残端和盆腔淋巴结复发，虽经放疗和紫杉醇+卡铂(TC方案)辅助化疗，仍迅速发展为癌性腹膜炎伴腹膜播散。

研究采用低血清培养体系从腹水分离肿瘤细胞，经STR分析证实细胞系与原发肿瘤遗传一致性达89.13%。KGAS细胞在免疫缺陷小鼠皮下移植后成功形成肿瘤，并保留GAS典型标志物Claudin-18和MUC6的表达。该细胞系展现显著自我更新能力，在低附着培养中形成单细胞来源球体（图1c）。更重要的是，KGAS对紫杉醇(PTX)和卡铂(CBDCA)的耐药性显著高于HeLa细胞，其IC₅₀值分别为338.2 nM和621.8 μM（图1e）。

为模拟临床耐药演进，研究团队通过低剂量药物暴露（每周15 nM PTX+15 μM CBDCA处理6周）获得耐药亚系rKGAS。该细胞呈现形态学改变和标志物表达变化：EpCAM与ALDH表达下调而CD44v9上调，提示癌症干细胞特性与上皮间质转化(EMT)参与耐药过程（补充图1b）。rKGAS对PTX和CBDCA的IC₅₀进一步提升至669.3 nM和708.2 μM（图3b）。

关键技术方法包括：1）从腹水样本通过离心洗涤和低血清培养建立原代细胞系；2）STR分析使用PowerPlex? Fusion 6C系统进行21个基因座验证；3）通过低剂量药物反复暴露构建耐药亚系；4）miRNA测序采用Ion S5?系统检测差异表达；5）CDX小鼠模型通过皮下注射Luc-KGAS细胞进行体内成瘤性验证。

研究结果

Establishment and chemoresistance of the KGAS cell line

KGAS细胞在低营养条件下形成球状结构（图1c），经10代培养后形成形态均一的大型肿瘤细胞群（图1d）。药物敏感性测试显示其对PTX和CBDCA的耐药性显著高于HeLa细胞，IC₅₀值分别高出169倍和1.8倍。

Establishment of CDX mouse model

Luc-KGAS细胞注射小鼠后，22只中有18只形成移植瘤（图2a）。活体成像证实肿瘤发光信号（图2b），组织学检查显示腺癌样结构且免疫组化确认Claudin-18与MUC6表达（图2c-d），证明KGAS在体内保持GAS表型。

Evaluation of phenotypic changes in rKGAS cells

rKGAS细胞出现核形态异常、层状生长和漂浮细胞增多等改变（图3a）。流式细胞术检测显示干细胞与EMT标志物表达谱变化，提示耐药表型与细胞可塑性相关。

miRNA profiling of differentially expressed miRNAs in rKGAS cells

miRNA测序鉴定出17个差异表达miRNA（7个上调、10个下调）。生物信息学分析显示：上调miRNA靶向癌基因BCL2（B细胞淋巴瘤2）、MET（肝细胞生长因子受体）、SIRT1（去乙酰化酶1）和VEGFA（血管内皮生长因子A）；下调miRNA则调控抑癌基因IGF1R（胰岛素样生长因子1受体）、TNFAIP3（肿瘤坏死因子α诱导蛋白3）和MTOR（ mechanistic target of rapamycin）（图3c-d）。

讨论与结论

本研究首次成功建立GAS来源细胞系KGAS及其耐药亚系rKGAS，填补了该领域模型空白。KGAS细胞在体内外均保持GAS的典型病理特征（Claudin-18⁺/MUC6⁺/p16^-），其强耐药性与癌症干细胞特性（球体形成、标志物表达）为研究GAS恶性进展提供了理想平台。耐药亚系的miRNA谱揭示通过协同调控多通路（凋亡、血管生成、代谢重编程）介导化疗耐药的分子网络，其中BCL2、MET、VEGFA等靶点的识别为开发联合疗法提供方向。

局限性与展望：当前流式分析与miRNA功能验证尚需深化，后续研究应通过功能实验（如miRNA过表达/敲低）验证靶基因调控机制，并结合转录组与全基因组测序全面解析GAS基因组特征。KGAS模型体系的建立不仅推动GAS生物学认知，更为开发靶向癌症干细胞或EMT过程的创新疗法奠定基础。