头颈癌患者来源白色念珠菌的氟康唑耐受性与毒力适应性研究

　　本刊推荐：本研究深入探讨了头颈癌（HNC）患者来源白色念珠菌（C. albicans）的氟康唑（FLC）耐受性机制及其毒力适应性。研究发现，尽管多数菌株对FLC敏感（MIC≤2 μg/mL），但鉴定出中度（MT）和高度（HT）耐受表型。FLC预防并未显著改变耐受性流行率，但HT分离株在药物压力下通过上调ERG11、ALS3、HWP1和SAP6等基因，显著增强了粘附能力和生物膜（biofilm）完整性，揭示了耐受性与毒力因子协同进化的新机制，为临床耐药菌感染防控提供了重要见解。

　　

Abstract

Background

白色念珠菌（Candida albicans）是导致免疫受损头颈癌（HNC）患者口腔念珠菌病的主要机会性病原体。氟康唑（FLC）广泛用于治疗和预防，但在癌症治疗期间持续性感染仍是临床难题。本研究假设，白色念珠菌在FLC暴露下的存活可能由耐受性或耐药性发展所驱动，并伴随毒力特征的改变。

Methods

本研究对来自HNC患者的临床白色念珠菌分离株进行了FLC敏感性和毒力特征分析。

Results

大多数分离株对FLC敏感，但鉴定出两种耐受表型：中度耐受（MT）和高度耐受（HT）。FLC预防未显著影响耐受性流行率或严重程度。两种耐受分离株均显示关键耐药基因ERG11的上调。在FLC暴露下，MT分离株适度增加了ALS1和SAP6的表达，同时下调其他毒力基因，与其粘附性和生物膜形成能力减弱相关。相反，HT分离株上调ALS3、HWP1和SAP6，增强粘附性并维持生物膜完整性。尽管两者均上调SAP6，但宿主细胞毒性相似。

Conclusion

这些发现突显了FLC耐受白色念珠菌在抗真菌压力下保留致病性的适应机制，为HNC患者的临床管理带来潜在挑战。

Introduction

白色念珠菌是一种常见的人类共生物，可在免疫受损个体（如接受同步放化疗（CCRT）的HNC患者）中转化为致病形式。这些患者因上皮屏障破坏、免疫应答受损和正常口腔菌群失衡而高度易感，从而促进从口腔念珠菌病（OC）到系统性感染的进展。FLC是一种三唑类抗真菌剂，因其良好的药代动力学特性和广谱抗真菌作用而广泛用于念珠菌病的治疗和预防。在癌症患者中，预防性FLC给药可降低OC发生率并限制念珠菌定植。然而，尽管广泛使用，OC仍在部分接受FLC预防的患者中发生。这种不完全保护表明白色念珠菌可能在抗真菌压力下采用适应性生存机制，可能导致治疗失败。

最近临床证据发现白色念珠菌分离株表现出氟康唑耐受性，这是一种不同于经典耐药的表型。与耐药性不同，耐受性 characterized by 真菌细胞亚群在药物浓度高于最小抑菌浓度（MIC）时缓慢生长的能力，而MIC值未改变。多种机制与白色念珠菌在FLC暴露下的存活有关，包括ERG11（编码FLC靶向酶）的点突变和外排泵CDR1、CDR2和MDR1的上调。这些适应不仅导致敏感性降低，还与毒力增强有关。例如，ERG11突变可能改变膜固醇组成，导致天冬氨酸蛋白酶（SAP4-6）和磷脂酶分泌增加，从而促进组织入侵和宿主细胞损伤。同样，外排泵（CDR1、MDR1）的过表达与菌丝特异性基因（HWP1、ECE1）的上调相关，这些基因对菌丝形态发生和生物膜基质发育至关重要。相反，一些研究表明外排泵的过度表达也可能损害某些临床分离株的毒力。

新兴证据表明，氟康唑耐受白色念珠菌菌株可能在宿主环境中表现出增强的适应性和持久性，导致慢性感染和治疗失败，尽管体外敏感性明显。耐受性可能调节关键毒力属性，如形态发生、生物膜形成、应激反应和水解酶分泌，这些是上皮入侵、免疫逃避和致病性的关键因素。然而，耐受性对宿主-病原体相互作用的影响，包括上皮屏障完整性和免疫调节，仍然知之甚少，尤其是在接受CCRT的HNC患者等高危人群中。

鉴于抗真菌耐受在药物存活和发病机制中的双重作用，需要进一步研究以阐明其临床和生物学意义。本研究旨在表征来自HNC患者的临床白色念珠菌分离株的FLC敏感性谱并评估相关毒力属性，包括毒力因子基因表达、粘附和生物膜形成能力以及与宿主上皮细胞的相互作用。研究结果旨在阐明氟康唑耐受性对白色念珠菌致病性的潜在贡献及其在免疫受损患者抗真菌管理中的意义。

Materials and methods

Samples collection

本研究收集了78例在清迈大学医学院放射科放射肿瘤科接受CCRT的HNC患者的浓缩漱口液样本。样本收集于2021年8月至2022年9月期间的放化疗期间。其中39例患者随机入选一项随机、双盲、安慰剂对照试验，研究氟康唑预防放射性口腔黏膜炎和念珠菌病的效果。参与者随机接受氟康唑（100 mg/d）或安慰剂治疗14天。口腔念珠菌病的临床诊断通过治疗期间的口腔检查进行。所有漱口液样本在-80°C保存直至分析。本研究经清迈大学研究伦理委员会批准（批准号：EC 8270/2565）。

Fungal culture, yeast isolation and identification

为分离念珠菌，漱口液样本离心分离上清液，沉淀接种于沙氏葡萄糖琼脂（SDA；Difco，底特律，密歇根州，美国） supplemented with 50 μg/mL氯霉素（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）以评估酵母定植。为初步鉴定念珠菌 species，样本 also cultured on CHROMagar? Candida（CHROMagar，巴黎，法国），一种可根据菌落颜色区分物种的显色培养基。接种采用涂布 plate 技术，随后在37°C孵育48小时。孵育后，记录SDA上的菌落计数，并基于CHROMagar上的菌落形态和色素产生对念珠菌 species 进行初步鉴定。分离的念珠菌菌落进一步通过分子方法（包括PCR和MALDI-TOF MS）进行物种水平鉴定和确认。用于念珠菌 species 鉴定的PCR引物序列见表1。

Fluconazole susceptibility and tolerance assays

临床白色念珠菌分离株对FLC的最小抑菌浓度（MIC）根据临床和实验室标准研究所文件M27-A4，采用肉汤微量稀释参考方法进行。FLC（Sigma-Aldrich，密苏里州，美国）溶解于二甲亚砜（DMSO；Sigma-Aldrich，密苏里州，美国）中，浓度为100 mg/mL，-20°C保存直至使用。酵母悬浮液 prepared in 无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS, pH 7.2）， then diluted in RPMI 1640 medium（pH 7.4；Sigma-Aldrich，密苏里州，美国），用吗啉丙磺酸（MOPS；Sigma-Aldrich，密苏里州，美国）缓冲，至终浓度0.5至2.5×10³ cells/mL。悬浮液分装至96孔圆底微量滴定板孔中，孔中含有系列FLC稀释液（范围64至0.125 mg/L）。板在37°C孵育24小时，MIC定义为与无药对照相比抑制50%细胞生长的最低FLC浓度。分离株根据CLSI M27-A4折点分类：敏感（MIC≤2 mg/L）、剂量依赖性敏感（MIC=4 mg/L）和耐药（MIC≥8 mg/L）。白色念珠菌SC5314作为对照菌株。

耐受性使用刃天青 based 代谢 assay 评估，以量化超MIC生长（SMG）。具有敏感MIC的分离株在含有亚抑制浓度FLC的RPMI 1640中孵育，并在48小时使用刃天青还原法测量代谢活性。SMG计算为相对于无药对照生长的百分比。分离株 classified as 中度耐受（MT, 50–80% SMG）或高度耐受（HT, >80% SMG）。该 assay 通过捕获抑制浓度以上的生长来补充标准MIC测定，定义耐受表型。

Analysis of fluconazole-resistant and virulence genes

RNA extraction and cDNA synthesis

为研究FLC耐药基因表达与MT和HT分离株特征的相关性，我们分析了FLC耐药基因表达。简要而言，预培养的白色念珠菌在4°C以10,000 rpm离心2分钟。弃上清，沉淀用PBS洗涤三次。总RNA使用NucleoZOL reagent（Macherey-Nagel，迪伦，德国）提取，并用1 U/μL rDNase I（Thermo Scientific，马萨诸塞州，美国）在37°C处理30分钟以去除残留DNA。RNA浓度使用NanoDrop?2000/2000c spectrophotometers（Thermo Scientific，马萨诸塞州，美国）定量，并通过β-肌动蛋白基因的PCR扩增确认无基因组DNA。RNA样本在-80°C保存。

cDNA合成 assay 根据Maxime RT Premix Oligo (dT) RT-PCR kit（iNtRON Biotechnology，城南市，韩国）方案进行。从每个RNA样本中，添加1 μg总RNA至混合反应中，并补充无核酸酶水至终体积20 μL。PCR条件如下：45°C 60分钟和95°C 5分钟。cDNA在-20°C保存用于后续实验。

Real-time RT-PCR (qRT-PCR)

ERG11、CDR1、CDR2和MDR1的基因表达水平通过qRT-PCR使用SensiFAST SYBR Lo-ROX（Bioline，伦敦，英国）和ABI 7500 Real-Time Detection System（Applied Biosystems，美国）进行量化。引物序列见表2。PCR protocol 为95°C 10分钟，随后40个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟。ALS3和SAP1基因在相同 protocol 下于57°C退火扩增。看家肌动蛋白（ACT1）基因用作qRT-PCR的内参对照，相对基因表达使用2^?ΔΔCt方法计算。

Assessment of virulence factors

Cell culture

人下咽癌上皮细胞系（FaDu）由清迈大学联合医学科学学院放射技术系Jiraporn Kantapan助理教授惠赠。细胞在Dulbecco改良 Eagle培养基（DMEM；Gibco，马萨诸塞州，美国）中维持， supplemented with 10%胎牛血清（FBS；Gibco，马萨诸塞州，美国）、500 U/mL青霉素和500 μg/mL链霉素（Pen/Strep；Gibco，马萨诸塞州，美国），在37°C、5% CO₂湿润培养箱中培养。对于感染 assays，FaDu细胞接种于24孔板，生长至80-90%汇合度。

Growth kinetics

预培养的酵母细胞用PBS洗涤三次，并在96孔板中于200 μL RPMI 1640培养基中调整至2.5×10³ cells。生长曲线在氟康唑处理和未处理条件下监测48小时。在多个时间点（0、12、24、36和48小时）测量600 nm光密度（OD₆₀₀）以生成每个分离株的详细生长曲线。

Filamentation assay

对于菌丝形成 assay，酵母细胞培养并在补充了MOP和10% FBS的RPMI 1640中调整至3×10⁵ cells/mL。在37°C孵育2小时后，细胞用4%多聚甲醛（4PFA；Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）固定，染色，并在40倍物镜的光学显微镜（Nikon Eclipse 50i，东京，日本）下观察。使用NIS-Elements D软件在10个随机视野中测量菌丝长度。

Adherence assay

为确定FLC耐受菌株对宿主细胞的粘附性，收集临床分离株（HT、MT和敏感分离株），用PBS洗涤两次，然后在4°C于0.05 M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中用0.1 mg/mL异硫氰酸荧光素（FITC；Sigma-Aldrich，密苏里州，美国）染色过夜。对于粘附 assay，FaDu细胞系以5的感染复数（MOI）与耐受或敏感的FITC标记白色念珠菌在37°C、5% CO₂下共培养90分钟。洗涤后，细胞用4PFA固定。白色念珠菌粘附百分比通过DxFLEX Flow Cytometer（Beckman Coulter，苏州，中国）检测。

Assessment of biofilm biomass and metabolic activity

a Biofilm biomass quantification

为研究HT分离株是否比MT分离株增强毒力，我们假设其表现出增加的生物膜能力。生物膜形成使用结晶紫（CV） assay 评估。酵母细胞（1×10⁶ cells/mL）接种于96孔板，在37°C孵育48小时。通过洗涤两次PBS去除未粘附细胞。生物膜用甲醇在室温固定15分钟，用0.1% CV染色15-20分钟，然后洗涤三次PBS以去除多余染料。结合的CV在200 μL 33%（v/v）冰乙酸中溶解，溶解CV的吸光度在595 nm使用酶标仪（BioTek? Synergy? H4 Hybrid Microplate Reader，佛蒙特州，美国）测量。生物膜生物量表示为相对于白色念珠菌参考菌株SC5314的百分比，该菌株以其高侵袭性和强大的菌丝及生物膜形成而闻名。每个分离株的吸光度值归一化至SC5314（定义为100%），以便在分离株和实验条件之间直接比较生物膜形成能力。

b Biofilm metabolic activity

生物膜代谢活性通过MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四唑溴化物）还原 assay 测量。制备MTT溶液（0.5 mg/mL in PBS），每孔加入100 μL，随后在37°C孵育4小时。孵育后，移除MTT溶液，加入100 μL二甲基亚砜（DMSO；Sigma Aldrich，密苏里州，美国）以溶解不溶性甲臜晶体。在450/620 nm（读取/参考）测量吸光度。所有实验重复三次并独立重复三次。

Epithelial cell damage assay

为确定氟康唑耐受性是否影响宿主细胞损伤，使用与白色念珠菌共培养的FaDu细胞进行LDH释放 assay。使用CyQUANT? LDH Cytotoxicity Assay kit（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国）评估细胞损伤。简要而言，FaDu细胞以MOI 5感染24小时。孵育时间后，根据制造商指南在490 nm测量上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性。细胞毒性百分比使用以下公式计算：%细胞毒性 = (共培养上清液 - FaDu细胞上清液) × 100 / (FaDu细胞裂解液 - FaDu细胞上清液)

Virulence gene expression

为评估毒力相关基因（ALS1、ALS3、HWP1、SAP1-3和SAP6）的转录反应，从代表性FLC耐受（MT和HT）和敏感白色念珠菌分离株提取总RNA，并从1 μg RNA合成cDNA。使用SensiFAST SYBR Lo-ROX（Bioline，伦敦，英国）在ABI 7500 Real-Time Detection System（Applied Biosystems，美国）上进行定量实时PCR。引物序列见表2。PCR条件为95°C 10分钟，随后40个循环的95°C 15秒和57–60°C 1分钟。ACT1用作归一化的看家基因，相对表达水平使用2^?ΔΔCt方法计算。在无药和亚抑制FLC条件下进行三次重复分析，以评估抗真菌压力下的转录适应。

Statistical analysis

所有实验重复三次并独立重复三次。数据表示为平均值±标准差。使用非配对t检验 followed by 单因素方差分析或双因素方差分析（如适用）确定统计显著性。使用GraphPad Prism version 10（GraphPad Software，加利福尼亚州，美国）进行分析。

Results

Yeast isolation and identification

从HNC患者口腔在不同放疗（RT）阶段（包括开始阶段、治疗期间和RT结束时）共收集225份临床样本。其中168份样本念珠菌 species 检测阳性，包括87份来自安慰剂组和71份来自FLC预防组。每组念珠菌 species 的分布见图1。在安慰剂组，白色念珠菌是最常分离的 species，在87份阳性样本中鉴定出55份（63.2%），其次是热带念珠菌（28.7%）、光滑念珠菌（12.6%）、克柔念珠菌（6.9%）和近平滑念珠菌（5.7%）。类似地，在FLC预防组，白色念珠菌仍然是主要 species，在71份阳性样本中检测出43份（60.5%），其次是光滑念珠菌（21.1%）、热带念珠菌（16.9%）、克柔念珠菌（16.9%）和近平滑念珠菌（9.8%）。

Fluconazole susceptibility and tolerance

根据CLSI M27-A4指南评估了98株临床白色念珠菌分离株的FLC敏感性。总共97株分离株（55株来自安慰剂组，43株来自FLC预防组）被 classified as FLC敏感，最小抑菌浓度（MICs）范围0.5至2 μg/mL。一株来自安慰剂组的分离株表现出剂量依赖性敏感（S-DD）表型，MIC为4 μg/mL。

为评估FLC耐受性，我们进行了刃天青 based 代谢 assay 以量化超MIC生长， reported as 48小时敏感性调节生长（SMG）。在每个治疗组中鉴定出两株FLC耐受分离株。在安慰剂组，两株分离株均表现出中度耐受，平均SMG值52.69%。相反，来自FLC预防组的两株分离株表现出高度耐受，平均SMG值89.69%。

Growth kinetics in FLC-tolerant isolates

为研究FLC耐受性对生长动态的影响，将代表性中度耐受（MT）、高度耐受（HT）和FLC敏感白色念珠菌分离株在含有或不含0.25 μg/mL FLC（一种亚抑制浓度）的RPMI 1640培养基中于37°C培养48小时。通过在0、12、24、36和48小时测量OD600监测生长。在无FLC情况下，所有菌株表现出相似的生长模式。在FLC暴露下，MT和HT分离株相对于敏感菌株维持持续生长，HT分离株在后期时间点（36–48小时）显示最高OD600，与增强的耐受性一致。这些结果表明耐受分离株中延迟但持续的生长反应，可能有助于其在抗真菌压力下的持久性。

Expression of fluconazole resistance genes

为阐明白色念珠菌中FLC耐受性的分子机制，我们检测了四种FLC耐药相关基因的表达水平：ERG11、CDR1、CDR2和MDR1。对代表性和高度耐受临床分离株以及参考菌株SC5314和FLC敏感临床分离株进行了定量实时PCR分析。如热图所示，FLC耐受分离株表现出显著升高的ERG11表达，该基因编码FLC的靶向酶羊毛固醇14α-去甲基酶。相反，外排泵基因CDR1、CDR2和MDR1的表达水平在耐受和敏感分离株之间相当。这些发现表明ERG11的过表达可能显著贡献于耐受表型，强调了靶向上调在临床白色念珠菌分离株中FLC耐受性的药物-靶点相互作用机制中的潜在参与。

Differential expression of adhesin genes and adhesion capacity in fluconazole-tolerant Candida albicans isolates

为研究FLC耐受性与毒力相关基因表达的关系，我们检测了三种粘附素基因（ALS1、ALS3和HWP1）的转录谱及其与MT和HT白色念珠菌分离株粘附能力的相关性。在未暴露条件和暴露于亚抑制浓度FLC后评估基因表达。热图分析显示，在无FLC情况下，MT和HT分离株均显示ALS1、ALS3和HWP1的上调表达，表明一种预激的粘附表型。然而， upon FLC exposure, 两种分离株之间的基因调控出现分歧。MT分离株表现出ALS3和HWP1的显著下调，而ALS1保持略微升高。相反，HT分离株显示不同的响应，ALS3表达显著上调，ALS1和HWP1水平维持。这些发现指出了对FLC应激的差异转录适应， particularly involving ALS3，一个与白色念珠菌粘附相关的关键基因。

为确定这些转录变化是否功能相关，我们使用FITC标记的酵母细胞与FaDu口腔上皮细胞共培养进行了定量粘附 assay。在未暴露条件下，两种分离株显示相当的粘附率，MT分离株为60.28%，HT分离株为64.52%，与其相似升高的粘附素基因表达一致。 Following FLC exposure, MT分离株表现出粘附显著减少（42.55%），与ALS3和HWP1的下调相关。相反，HT分离株在FLC应激下显示显著增强的粘附率81.80%，与FLC应激下ALS3的上调一致。这些结果突出了ALS3表达与FLC耐受白色念珠菌分离株粘附能力之间的强关联。此外，在MT和HT分离株中观察到的差异转录和表型响应表明FLC暴露可以以耐受表型依赖性方式调节毒力相关粘附。

Hyphal formation in FLC-tolerant isolates under FLC stress

为进一步研究FLC耐受性是否与形态可塑性相关， particularly 菌丝形成，使用中度耐受（MT）和高度耐受（HT）白色念珠菌分离株进行了菌丝形成 assay。两种分离株在富集RPMI 1640培养基中于37°C孵育2小时以诱导菌丝发育。在未暴露条件下，MT分离株表现出略高的菌丝形成百分比（64.14%） compared to HT分离株（52.11%），尽管差异无统计学显著性。 Upon exposure to a sub-inhibitory concentration of FLC, MT分离株中的菌丝形成显著减少至47.86%，表明对FLC诱导的形态抑制的敏感性。相反，HT分离株在FLC应激下维持其菌丝形成率， demonstrating 更大的形态恢复力。

为进一步评估FLC是否影响菌丝伸长，测量了平均菌丝长度。两种分离株在对照条件下表现出相似的菌丝长度。 Following FLC exposure, HT分离株显示轻微、非显著的菌丝长度减少，而MT分离株显示更明显但 also 非显著的减少。这些发现表明FLC暴露在MT分离株中比在HT分离株中更强烈地抑制菌丝形成。HT分离株中保留的菌丝形成能力可能与在抗真菌应激下持续的HWP1表达相关，如在先前的基因表达分析中观察到的。

Biofilm formation contributes to differential responses to FLC exposure in tolerant Candida albicans isolates

生物膜形成是白色念珠菌中的关键毒力性状，通过限制抗真菌渗透和促进微生物持久性而贡献于FLC耐受性和耐药性。为评估FLC耐受分离株的生物膜形成能力，在48小时生物膜发育后，使用结晶紫（CV）染色和MTT还原 assay 分别量化总生物量和代谢活性。

在未暴露条件下，MT分离株产生的生物膜生物量相当于参考菌株白色念珠菌SC5314的82.35%（设为100%）。 Upon exposure to a sub-inhibitory concentration of FLC, MT分离株中的生物膜生物量显著减少至56.75%。相反，HT分离株表现出更具恢复力的生物膜表型，生物量相对SC5314仅从79.38%略微减少至71.38% after FLC treatment。这些发现表明MT和HT分离株中对FLC的 distinct 生物膜相关响应。MT分离株中生物膜形成的 substantial 减少表明对FLC介导 disruption 的敏感性增加。相反，HT分离株中生物膜完整性的相对保存可能反映了限制FLC渗透或减轻抗真菌应激的适应机制。这种生物膜稳定性可能有助于在抗真菌压力下在HT分离株中观察到的增强持久性和耐受表型。

有趣的是，通过MTT assay 测量的代谢活性在未暴露和FLC暴露条件之间在MT或HT分离株中均未显示显著差异。这一发现表明总生物膜生物量的变化主要归因于分离株形成和维持生物膜结构能力的差异，而不是生物膜细胞自身代谢活性的改变。

Differential expression of SAPs genes in FLC-tolerant Candida albicans isolates

为进一步探索抗真菌耐受性与毒力之间的关系，我们分析了分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAPs）基因（SAP1、SAP2、SAP3和SAP6）在MT和HT分离株中在未暴露和FLC暴露条件下的表达谱。

在未暴露条件下，MT分离株 exhibited 所有SAP基因的下调，表明蛋白酶活性的低基线水平。相反，HT分离株 exhibited 不同的表达模式，SAP1和SAP2下调，而SAP3和SAP6上调，表明即使在无药物应激下 also 增强特定蛋白酶的表达。 Following exposure to a sub-inhibitory concentration of FLC, MT分离株 displayed SAP3和SAP6的上调，而SAP1保持抑制，SAP2表达保持不变。在HT分离株中，FLC暴露导致SAP1、SAP2和SAP3的抑制，而SAP6表达 further 上调。这些发现表明SAP6在两种耐受分离株中在FLC应激下 consistently 诱导，可能贡献于适应性毒力响应。HT分离株中SAP6的强烈和选择性上调可能增强其在药物暴露或免疫受损宿主环境中组织入侵和存活的能力，支持持久性。

Variation in cytotoxicity induced by FLC-tolerant Candida albicans isolates

分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAPs）是白色念珠菌中的关键毒力因子，贡献于上皮粘附、宿主组织降解和营养获取。 Given the distinct SAP基因表达谱在FLC耐受分离株中观察到的，我们假设差异SAP表达可能影响宿主细胞损伤程度。为评估细胞毒性，FaDu口腔上皮细胞用MT或HT分离株感染24小时。然后使用乳酸脱氢酶（LDH）释放 assay 量化细胞损伤，该 assay 作为细胞膜完整性和存活力的标志。

对于MT分离株，宿主细胞存活率保持高位且在未暴露和FLC暴露条件之间相当（分别为89.22和87