EliteMHCII：高通量MHC II免疫肽组平台揭示SARS-CoV-2 RBD特异性CD4+ T细胞表位及其免疫原性

　　为解决MHC II限制性表位鉴定中质谱灵敏度低、计算预测准确性不足的问题，研究人员开发了高通量免疫肽组平台EliteMHCII，系统评估了24种常见HLA-DR等位基因与SARS-CoV-2 RBD肽段的结合亲和力，发现高亲和力肽段可有效激活CD4+ T细胞应答，为感染性疾病和癌症免疫治疗的疫苗设计提供了新策略。

　　

CD4⁺ T细胞在适应性免疫中扮演着关键角色，它们通过识别抗原呈递细胞（APCs）表面MHC II（主要组织相容性复合体II类）分子所呈现的肽段抗原，在感染和肿瘤发展过程中协调B细胞产生高质量抗体、激活细胞毒性CD8⁺ T细胞，并直接清除病毒感染或肿瘤细胞。然而，当前鉴定MHC II表位的方法存在显著局限性：质谱技术（如LC-MS/MS）灵敏度低、通量有限，难以全面覆盖多样化的HLA类型；计算预测算法（如NetMHCIIpan）准确性参差不齐，尤其对MHC II结合肽的预测可靠性较低。这些挑战严重制约了针对传染性疾病和癌症的肽疫苗开发。

为了突破这些瓶颈，Jing Chen、Xu Zhu、Jun Huo等研究人员开发了名为EliteMHCII的高通量免疫肽组分析平台。该平台能够快速鉴定抗原衍生的MHC II表位，并定量测量肽段与24种全球常见MHC II等位基因的结合亲和力。研究人员以SARS-CoV-2 RBD（受体结合域）蛋白为例，系统评估了其免疫优势表位，并在疫苗接种个体和人源化小鼠模型中验证了高亲和力肽段与强效CD4⁺ T细胞应答之间的密切关联。相关研究成果发表在《Biomedical Technology》上。

在技术方法上，作者首先采用哺乳动物细胞Expi293F表达可溶性knob-into-hole Fc标记的MHC II蛋白，经Ni柱纯化和尺寸排阻色谱验证构象完整性；利用等位基因频率数据库（AFND）选取覆盖全球83.9%人口的24种HLA-DR等位基因；通过饱和结合和竞争性结合实验（引入HLA-DM介导的肽交换）定量测定肽段与MHC II的亲和力（EC₅₀和IC₅₀）；结合分子动力学模拟分析关键氨基酸突变对结合自由能的影响；利用肽-MHC II四聚体染色从疫苗接种者PBMCs和人源化小鼠脾细胞中检测抗原特异性CD4⁺ T细胞应答；最后通过ELISA测定血清抗体滴度。

2.1. Establishment of Exploring Landscape assay of immunogenic T cell epitopes for MHC II, EliteMHCII

研究人员成功建立了EliteMHCII平台，可高效表达、纯化24种HLA-DR蛋白（覆盖全球97.4%人群），并验证其与生物素化人源CLIP肽段的结合特性。饱和结合实验显示，多数等位基因与CLIP的亲和力在0-25 nM范围内，而DRB1 * 13:01和DRB1 * 13:02亲和力较低（分别为300 nM和4000 nM）。竞争性结合实验进一步证实了平台可准确测定肽段置换CLIP的抑制常数（K_i），与既往报道的解离常数（K_d）高度一致。进化树分析将24种HLA-DR分为四大类，提示等位基因多态性调控了与CLIP的结合差异。

2.2. Molecular dynamics simulation of affinity differences between HLA-DR and CLIP

针对DRB1 * 13:01和DRB1 * 13:02与CLIP结合的亲和力差异，分子动力学模拟揭示：V170G突变导致DRB1 * 13:02疏水核心体积减小，苯丙氨酸（F173和F48）侧链空间排列改变，进而影响CL肽结合取向和氢键形成（如R7'与D112/E11或D112/E155相互作用）。结合自由能（ΔG_bind）计算表明DRB1 * 13:01（-39.94 kcal/mol）结合稍强于DRB1 * 13:02（-38.24 kcal/mol），静电能量（ΔE_ele）主导结合过程，与实验数据一致。

2.3. EliteMHCII for peptide screening

以SARS-CoV-2 RBD的53条重叠肽段（15-mer，4aa重叠）为模型，EliteMHCII系统筛选了其与24种HLA-DR的结合亲和力。定义高亲和力（<100 nM）、中亲和力（100 nM-1 μM）和低亲和力（1-10 μM）后，发现不同等位基因呈现肽段能力差异显著：DRB1 * 07:01等5种等位基因可高效呈递多数RBD肽段（>60%肽段亲和力>10 μM），而DRB1 * 01:02等5种等位基因呈递能力较弱（<30%）。群体覆盖分析显示，RBD_323-337、RBD_339-353、RBD_447-465和RBD_511-525等高亲和力肽段可覆盖50%全球人群。值得注意的是，奥密克戎变异株（BA.5、BA.2.86、JN.1）的RBD_447-461肽段（含L455S突变）与11-12种HLA-DR的结合亲和力显著降低，尤其是JN.1变异株完全丧失与DRB1 * 15:01和DRB1 * 11:04的结合能力，提示潜在免疫逃逸风险。

2.4. Comparison of EliteMHCII and NetMHCIIpan

与NetMHCIIpan-4.1预测算法对比显示，16种DRB1等位基因的实测亲和力与预测值高度相关（r≥0.5），4种中等相关（0.3≤r<0.5），而DRB1 * 12:02等4种等位基因无显著相关性（p>0.05）。这表明计算预测在某些等位基因上存在局限性，凸显了EliteMHCII生成高保真训练数据集的重要性。

2.5. EliteMHCII demonstrates proficient presentation of immunogenic CD4⁺ T cell epitopes

通过肽-MHC II四聚体染色，在8名疫苗接种者（携带9种不同HLA-DR型别）的PBMCs中检测10条RBD肽段（涵盖高、中、低亲和力）的特异性CD4⁺ T细胞应答。结果显示，高亲和力肽段（如RBD_323-337、RBD_483-497、RBD_511-525）均能检出阳性T细胞群体，而低亲和力肽段则无法诱发应答或应答微弱。统计证实亲和力与免疫原性高度一致（低亲和力肽段符合率>75%，高亲和力肽段在11/16案例中符合率>66%）。

2.6. Evaluation of peptide vaccine immunogenicity in humanized mouse models

在人源化免疫系统小鼠模型中，接种高亲和力肽段（RBD_399-413、RBD_431-445、RBD_447-461）可诱导更高水平的血清IgM抗体滴度和肽段特异性CD4⁺ T细胞频率（经四聚体染色和CD69⁺CD25⁺活化标志物验证），而低亲和力肽段（RBD_395-409等）几乎无法激活T细胞。这表明EliteMHCII筛选的高亲和力肽段在体内具有强免疫原性。

研究结论与讨论部分强调，EliteMHCII平台在效率、灵敏度、通量和可行性方面显著优于传统方法（如质谱、酵母展示、哺乳动物细胞展示）。它可在48小时内完成384样本的高通量筛选，提供定量亲和力数据（K_i、IC₅₀），并整合从生物物理结合到功能性免疫验证的全流程。该平台不仅成功揭示了SARS-CoV-2 RBD的免疫优势表位分布和变异株逃逸潜在机制，还证明了肽段-MHC II亲和力与CD4⁺ T细胞免疫原性的直接相关性。

这些发现对传染病监测、新抗原鉴定和精准肽疫苗设计具有重要应用价值。通过提供一种快速、定量、种群覆盖广泛的表位筛选方案，EliteMHCII有望推动基于T细胞免疫的疫苗开发和个体化癌症免疫治疗策略的进步。