基于无标记二次谐波显微成像的亚细胞钙信号预测：利用条件对抗网络实现结构到功能的图像翻译

　　本研究利用pix2pix条件对抗网络，首次实现了基于肌球蛋白丝无标记二次谐波生成(SHG)信号的钙火花(Ca2+ sparks)预测。研究人员通过开发专门的图像预处理算法增强信号质量，成功预测了骨骼肌纤维中Ca2+ sparks的频率分布和空间特征（特别是y型结构和纤维外周区域），为无标记光学显微技术预测快速亚细胞信号提供了创新方法，对肌肉生理研究和疾病模型分析具有重要意义。

　　

在生物医学研究领域，实时观测细胞内钙离子(Ca²⁺)动态一直是科学家们关注的重点。钙火花(Ca²⁺ sparks)作为细胞内一种快速、局域化的钙信号事件，在肌肉收缩、细胞分化、基因表达等多种生理过程中扮演着关键角色。传统上，研究人员需要使用荧光钙指示剂（如Fluo-4 AM）来标记和观察这些瞬态信号，但这种方法存在光毒性、光漂白以及可能干扰细胞正常功能等问题。

随着光学显微技术的进步，无标记成像方法如二次谐波生成(Second Harmonic Generation, SHG)显微镜为观察细胞结构提供了新的途径。SHG技术特别适用于观察具有非中心对称结构的生物分子，如肌球蛋白丝，无需任何外源标记即可获得高对比度的结构图像。然而，能否基于这些结构信息来预测功能性的钙信号事件，一直是领域内待解的重要科学问题。

为了回答这一问题，来自德国科隆大学医院实验眼科的Tihomir Georgiev开展了一项创新性研究，探索基于肌球蛋白丝SHG信号预测钙火花的可行性。研究人员采用条件对抗网络（pix2pix算法）进行图像翻译任务，将结构图像转换为功能图像，最终实现了从无标记SHG测量中预测Ca²⁺ sparks的目标。这项研究工作发表在《Computers in Biology and Medicine》期刊上，为无标记光学显微技术在生理功能研究中的应用开辟了新途径。

研究采用的关键技术方法包括：基于TensorFlow框架的pix2pix条件对抗网络进行图像翻译训练；专门开发的图像预处理算法用于增强Ca²⁺ sparks信号；野生型小鼠(C57BL)骨骼肌纤维样本的SHG和双光子显微同步成像；自动Ca²⁺ sparks识别和定量分析流程；以及多种统计指标（包括结构相似性指数SSIM、 Matthews相关系数等）评估预测准确性。

3.1. 生成翻译图像

研究人员首先通过图像预处理增强Ca²⁺ sparks与细胞背景信号的对比度，然后使用4123张256x256像素的图像对网络进行训练，这些图像包含818个Ca²⁺ sparks。训练后的网络能够将SHG图像成功转换为Ca²⁺图像，预测出的Ca²⁺ sparks在多个图像序列中持续出现，部分预测信号位于肌球蛋白丝的y型结构区域。通过结构相似性指数(SSIM)和均方误差(MSE)评估显示，翻译图像在三个独立实验中都达到了较高的质量。

3.2. 翻译Ca²⁺图像的特性

研究发现预测的纤维掩模与真实纤维掩模高度相似，预测的Ca²⁺ sparks面积在实验1中与真实数据吻合良好。预测的Ca²⁺ sparks频率在实验1中为2.52 sparks/(10,000?μm²)，与真实频率3.05 sparks/(10,000?μm²)接近；在实验3中预测频率(2.78)与真实频率(2.74)几乎完全一致。然而在实验2中，预测频率(2.46)与真实频率(4.36)存在较大差异，表明对不同纤维平面的预测存在挑战。

3.3. 将亚细胞结构转换为快速亚细胞信号

研究证实了大多数预测和真实的Ca²⁺ sparks位于纤维外周区域，这与先前报道的Ca²⁺ sparks分布特征一致。预测的Ca²⁺ sparks在肌球蛋白丝上的覆盖面积比例较低，部分预测信号出现在无肌球蛋白丝区域。特别重要的是，研究发现预测的Ca²⁺ sparks频率在y型结构处与真实数据存在一定相关性：在实验1中预测频率(7.94)高于真实频率(6.31)；实验3中预测频率(13.93)显著高于真实频率(8.95)；而实验2中未预测到y型结构处的Ca²⁺ sparks，但真实数据中存在此类信号。

3.4. Ca²⁺ sparks预测的准确性

分析显示，在所有图像翻译中持续出现的预测Ca²⁺ sparks多次与高真实Ca²⁺ sparks活性区域相邻，部分预测信号与真实信号存在重叠。然而，精确重叠度不高，这反映在较低的Pearson相关系数、Matthews相关系数和F1分数上。持续出现的预测Ca²⁺ sparks通常位于y型结构或其附近区域。

3.5. 算法是翻译亚细胞结构还是信号？

为探究算法是否将SHG信号中的局部变化转换为Ca²⁺信号，研究人员分析了Ca²⁺ sparks区域SHG信号与纤维平均SHG信号的比率。结果显示训练数据呈现负Pearson相关性(-0.1896)，而各实验的预测数据大多也呈现负相关性，表明算法主要将亚细胞结构信息转换为亚细胞信号，而非将SHG信号变化直接转换为Ca²⁺信号。

研究结论表明，基于无标记SHG测量预测的Ca²⁺信号多个特性与真实Ca²⁺信号吻合良好。Ca²⁺ sparks频率、纤维面积和Ca²⁺ sparks面积（在实验1中）能够被较好地预测。大多数预测的Ca²⁺ sparks位于纤维外周区域，符合预期。

讨论部分指出，实验2中较差的预测效果表明，即使是同一纤维的不同平面，由于其肌球蛋白模式和相关Ca²⁺ sparks信号模式不同，也构成了不同的预测场景。y型结构处Ca²⁺ sparks频率预测的差异可能是由于数据集较小或特定肌球蛋白模式特性所致。持续出现在所有图像翻译中的预测Ca²⁺ sparks多次与高真实Ca²⁺ sparks活性区域相邻，表明预测具有一定的生物学相关性。

重要的是，研究表明算法主要翻译的是亚细胞结构而非亚细胞信号，这意味着预测是基于肌球蛋白丝的静态结构信息而非SHG信号的动态变化。尽管如此，这种方法仍具有重要价值，特别是在需要避免使用荧光标记的情况下。

该技术的潜在应用范围不仅限于钙信号预测，还可扩展至其他无标记显微技术和荧光指示剂，如多巴胺、乙酰胆碱、谷氨酸、GABA、ATP、血清素、去甲肾上腺素和腺苷等指标的预测。未来通过结合三维体积数据、数据增强、更大型数据集和专门设计的算法，有望进一步提高图像翻译的准确性。

这项研究首次证明了基于无标记SHG成像预测功能性钙信号的可行性，为光学显微技术在生理功能研究中的应用提供了新范式，特别是在肌肉生理学和相关疾病模型研究中具有重要价值。随着技术的进一步改进，无标记SHG测量结合先进的图像翻译算法可能在某些情况下替代传统的钙指示剂使用，为活细胞成像研究开辟新的可能性。