综述：利用原位冷冻电镜阐明RNA病毒复制中的可成药暗物质

　　本综述系统探讨了原位冷冻电镜（cryo-EM）技术在RNA病毒复制机制研究中的突破性应用，重点聚焦HIV-1成熟、正链RNA病毒膜结合复制器（ROs）及负链RNA病毒无膜病毒工厂（VFs）等关键环节。作者通过高分辨率结构解析揭示了病毒蛋白在天然环境中的构象变化（如CA晶格重组）、小分子辅因子（如IP6）的作用机制以及抗病毒药物（如Lenacapavir）的靶向原理，为开发靶向病毒复制“暗物质”的新型抗病毒策略提供了结构生物学依据。

　　

病毒复制中的结构暗物质与原位冷冻电镜革命

病毒蛋白在复杂病毒颗粒或宿主细胞环境中的功能机制一直是结构生物学的挑战。传统单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）难以捕捉这些动态过程，而原位冷冻电镜（包括冷冻电子断层扫描技术cryo-ET）通过直接观察天然环境中的病毒结构，揭示了RNA病毒复制中此前无法解析的“暗物质”。本综述以三类RNA病毒为例，探讨了原位冷冻电镜如何推动抗病毒策略的开发。

HIV-1成熟：从晶格重组到药物靶点

HIV-1的Gag蛋白是病毒组装、成熟及核衣壳核孔穿越的核心执行者。其结构域包括膜结合区（MA）、衣壳区（CA）、核酸招募区（NC）和病毒释放区（p6）。未切割的Gag通过CA-CA相互作用组装成六边形未成熟晶格，并通过与磷脂酰肌醇(4,5)二磷酸结合介导膜弯曲。

蛋白酶切割Gag后，释放的CA结构域重组为成熟的锥形衣壳核心，其中包含约1100-1300个CA分子，通过十二个五聚体位点以富勒烯方式闭合。原位冷冻电镜研究发现，宿主细胞来源的肌醇六磷酸（IP₆）是成熟关键辅因子，在未成熟和成熟CA晶格的六倍对称轴处分别协调一个和两个IP₆分子。另一辅因子SP2肽段则触发MA晶格成熟。

抗病毒药物Lenacapavir（已获批）通过结合成熟CA六聚体界面，加速异常核心形成，并在未成熟晶格中以不同构象发挥双重作用。早期候选药物Bevirmat则通过稳定CA-SP1区域抑制切割。此外，冷冻断层扫描显示完整HIV-1核心可穿越核孔复合体（NPC），导致核环“开裂”。这些发现凸显了成熟过程作为抗病毒靶点的复杂性及其结构基础。

正链RNA病毒：膜结合复制器与颈环复合物

正链RNA病毒通过重塑细胞膜形成复制器（ROs），其膜拓扑结构与病毒进化分类（Kitrinoviricota与Pisuviricota门）相关。例如，黄病毒和甲病毒（Kitrinoviricota）在胞膜形成芽状ROs，而冠状病毒和肠道病毒（Pisuviricota）则生成单/双膜囊泡（DMVs）。

冷冻电镜发现ROs的共有特征是其颈部分离处存在病毒蛋白复合物。 Flock House病毒（ nodavirus ）的颈环由非结构蛋白A的同源十二聚体双环构成，其原冠结构可通过单颗粒分析达到原子分辨率。甲病毒（如基孔肯雅病毒）的nsP1形成十二聚体环，与聚合酶nsP4和解旋酶nsP2共同组装成约2MDa的颈环复合物，其中仅部分nsP1参与RNA加帽。

登革病毒ROs形成机制被小分子抑制剂（如JNJ-A07和JNJ-1802）靶向NS4B蛋白所阻断，但其结构基础尚未解析。冠状病毒ROs由跨膜蛋白nsp3和nsp4组装成DMVs，其颈环包含四个六聚体环及中央带正电的RNA通道。相比之下，脊髓灰质炎病毒的衣壳组装发生在ROs胞质侧，提示其复制机制可能偏离颈环范式。

负链RNA病毒：无膜病毒工厂与液相聚集

非节段负链RNA病毒（如埃博拉病毒EBOV和呼吸道合胞病毒RSV）在胞质内形成无膜病毒工厂（VFs），具有液相凝聚属性。EBOV核衣壳（NC）由核蛋白（NP）以螺旋方式包裹基因组，每分子NP结合六个碱基，并伴随VP24和VP35的调控。

RSV的NC结构类似，但病毒颗粒内呈现混合螺旋和环状形态。VFs的液相行为使其成为药物靶点：化合物环巴胺（cyclopamine）通过固化RSV VFs抑制复制，砷酸盐处理则可改变腮腺炎病毒VFs中核衣壳的形态。

对EBOV VFs的冷冻电镜研究显示，早期VFs由松散卷曲的核衣壳（推测具转录活性）组成，并被波形蛋白（vimentin）包裹；晚期VFs则因VP24诱导的压缩形成紧密卷曲的核衣壳，其长度与病毒基因组完全对应，提示其作为成熟病毒颗粒前体。STA分析进一步在细胞内NC表面识别出VP35和额外NP分子（NP3）。

技术前沿：从细胞到组织的原位结构解析

原位冷冻电镜的技术进步极大拓展了其应用范围。冷冻关联光镜电镜（cryo-CLEM）结合超分辨荧光显微镜与FIB-SEM，实现了对感染事件的高精度定位。新型标记技术（如FerriTags和可克隆无机纳米颗粒）提高了标记特异性与对比度。

等离子FIB milling提升了切片效率与质量，允许对高压冷冻的组织样本（如感染病毒的多细胞体系）进行原位分析。提升式切片（lift-out）技术则支持大规模连续切片，实现大范围组织的高分辨率断层扫描。尽管STA已可对核糖体等高分对称结构实现侧链级分辨率，对低丰度目标的解析仍需结合预测模型与上下文分析（如膜形态与组分互作）。

结语

原位冷冻电镜通过揭示病毒在天然环境中的结构变化，为靶向传统“不可成药”的病毒复制环节提供了新视角。从HIV-1成熟的双重药物作用到正链病毒颈环复合物的多样性，再到负链病毒工厂的液相分离特性，这些发现不仅深化了对病毒复制的理解，也推动了新型抗病毒策略的开发。随着技术的持续革新，原位冷冻电镜有望在更复杂的生物环境中解锁更多病毒学谜题。