优化型水平成像毛细管等电聚焦方法的开发与验证：提升单抗电荷异质性分析的准确性与标准化

　　本研究针对单抗电荷异质性分析中缺乏标准化icIEF方法的迫切需求，开发了一种基于欧洲药典概念的新型优化方法。通过改进两性电解质组合比例与稳定剂配比，显著提升了pI测定的准确度、精密度和线性范围，经ICH Q2(R2)验证证实其可靠性。该方法为单抗质量控制提供了跨产品适用的高水平分析工具，对监管机构和生产企业具有重要应用价值。

　　

在生物制药领域，单克隆抗体（mAbs）已成为治疗癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病的关键药物。然而，这些复杂大分子容易发生多种翻译后修饰（PTMs），导致产生带有不同电荷的变异体，这种电荷异质性被监管机构认定为临界质量属性（CQA），因其可能影响药物的药代动力学特性、生物活性和免疫原性风险。

目前，成像毛细管等电聚焦（icIEF）技术因其高分辨率、自动化和高通量特点，已成为电荷变异体分析的金标准方法。但随着单抗药物在临床中的广泛应用，不同实验室使用的产品特异性分析方法缺乏 harmonization（协调一致），导致结果可比性差，特别是在监管机构的大规模质量控制活动中，这一问题变得尤为突出。欧洲药典（Ph. Eur.）虽然近期发布了关于单抗电荷变异体分析的一般章节（2.5.44），但其中描述的icIEF方法仍存在准确性不足的局限，特别是在等电点（pI）测定方面，不同仪器类型间的测量差异可超过0.2个单位。

为了解决这一紧迫需求，来自意大利国家药品控制和评价中心的研究团队开展了一项创新性研究，开发并验证了一种优化的、跨产品适用的icIEF方法。该方法以欧洲药典的一般方法为起点，通过系统性的方法学改进，显著提升了pI测定的准确性和方法的可靠性。研究成果发表在《European Journal of Pharmaceutical Sciences》上，为单抗电荷异质性分析提供了新的技术标准。

研究人员采用的关键技术方法包括：优化两性电解质（Pharmalyte）的组合比例（5-8和8-10.5，比例1:1.4）以改善pH梯度线性；调整阴阳极稳定剂（IDA和L-Arg）的浓度比例（1.67:1）以增强聚焦稳定性；延长聚焦时间至11.5分钟以确保充分分离；使用经认证的pI标记物（pIMs）作为系统适用性指标验证方法准确性；并按照ICH Q2(R2)指南进行全面方法验证，涵盖特异性、准确度、精密度、线性和定量限等参数。所有分析均在Maurice icIEF仪器（ProteinSimple）上进行，以英夫利昔单抗作为内部对照品。

3.1. Method Development and Optimisation Strategy

研究团队开发了一套系统化的方法优化策略。与欧洲药典方法使用宽范围（3-10）和窄范围（8-10.5）两性电解质组合不同，新方法采用两个相邻的窄范围Pharmalyte（5-8和8-10.5），专门针对单抗的pI范围（6-10）定制pH梯度。通过精细筛选，确定了最佳比例为1:1.4，并将校准pI标记物从5.85替换为6.14，以更好地适应新的pH梯度窗口。稳定剂比例经过系统优化，发现IDA:L-Arg比例为1.67:1时能提供最佳性能而不影响pI测量准确性。

3.2. Statistical comparison between methods

通过严格的统计比较证实了新方法的优越性。研究人员在系统适用性样品中加入了两个经认证的pI标记物（6.61和9.50），通过学生t检验证明优化方法测得的值更接近认证值：对于pIM 6.61，优化方法的平均测量值为6.557（差异0.053），而欧洲药典方法为6.204（差异0.406）；对于pIM 9.50，优化方法为9.581（差异0.081），欧洲药典方法为9.384（差异0.116）。线性回归分析显示，优化方法的斜率更接近1（1.02 vs 1.11），截距更接近0（-0.11 vs -1.21），表明其准确性显著提高。

3.3. Method Validation

方法验证结果表明优化方法符合ICH Q2(R2)要求。特异性实验证明该方法能清晰区分不同单抗的电荷谱和pI值。准确度评估显示，对认证pIM的回收率在99.2%-100.9%之间（接受标准90%-110%）。精密度研究显示，pI值的重复性RSD为0.13%，中间精密度RSD为0.32%；面积百分比的重复性SD在0.207%-0.302%之间，中间精密度SD在0.643%-1.466%之间，均满足接受标准。方法在0.2-0.6 mg/mL范围内表现出良好的线性和准确性，定量限确定为0.2 mg/mL。

研究结论和讨论部分强调，这是首个基于欧洲药典框架且经过全面验证的优化型icIEF平台方法。该方法通过使用两个相邻窄范围两性电解质和优化稳定剂比例，创造了更适合单抗分析的pH梯度，显著提高了pI测量的准确性。经认证pI标记物的使用为方法开发提供了可靠的导向指标，而严格的统计验证确保了结果的可靠性。

这项研究的重要意义在于：首先，它响应了监管机构和行业对单抗分析"水平标准"的迫切需求，提供了一种跨产品适用的标准化方法；其次，证明准确的pI测定可作为可靠的 identity（身份）参数，特别是在缺乏参比标准的 anti-counterfeiting（防伪）场景中具有重要价值；最后，该方法有望简化质量控制流程，减少试剂成本和分析时间，提高不同实验室间结果的可比性。

研究人员鼓励监管机构、工业界和学术界开展合作，推动该方法成为全球单抗电荷异质性分析的标准工具，并进一步探索其在更广泛生物制药产品中的应用前景。这项研究不仅为单抗质量控制提供了技术解决方案，也为生物类似药开发和 regulatory evaluation（监管评估）建立了新的分析方法标准。