透明质酸对肺表面活性物质功能的增强作用及在临床制剂开发中的应用研究

　　本研究针对肺表面活性物质(PS)在呼吸窘迫等病理条件下易失活、现有替代疗法(SRTs)效率不足的问题，通过生物物理技术系统分析了透明质酸(HA)对支气管肺泡灌洗来源天然表面活性物质(NS)的结构与功能调控作用。结果表明HA能诱导NS膜结构重组形成更紧密的脱水状态，显著提升其界面吸附、铺展能力和抗失活稳定性，且该效应在去除HA后仍持续存在。这为开发新型高效肺表面活性物质制剂提供了重要策略，对改善急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和胎粪吸入综合征等难治性呼吸疾病的治疗具有积极意义。

　　

在人体肺部，微小的肺泡如同数百万个微型气囊，通过持续收缩扩张实现气体交换。这一过程的顺利进行离不开肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)的关键作用——这种由Ⅱ型肺泡细胞合成的脂蛋白复合物，能在肺泡气-液界面形成表面活性薄膜，将表面张力降至极低水平，防止肺泡在呼气末塌陷。当PS缺乏或功能受损时，就会引发严重的呼吸系统疾病。

新生儿呼吸窘迫综合征(Neonatal Respiratory Distress Syndrome, NRDS)就是典型的PS缺乏性疾病，曾导致成千上万早产儿死亡。虽然表面活性物质替代疗法(surfactant replacement therapies, SRTs)通过气管内注入外源性PS显著降低了死亡率，但现有制剂仍存在明显局限性。特别是对于急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)和胎粪吸入综合征等疾病，由于肺部炎症和损伤物质会导致PS功能抑制，外源性PS同样会迅速失活，使得SRTs效果不佳。此外，天然来源的临床PS制剂还存在生产成本高、批次间差异大和潜在病原体传播风险等问题。因此，开发性能增强的新型PS制剂一直是研究人员追求的目标。

以往研究表明，某些聚合物能增强PS活性并提高其抗失活能力。其中，透明质酸(hyaluronic acid, HA)作为一种天然存在于肺部的离子聚合物，与PS在生理和病理状态下都存在相互作用，且相对较低浓度的HA就能对PS产生有益效果。然而，HA对PS功能增强的具体机制以及这种增强效应是否持久，仍有待深入探索。

发表在《European Journal of Pharmaceutical Sciences》上的这项研究，系统探讨了HA对PS性能的增强作用及其机制，为开发新一代临床PS制剂提供了重要见解。

研究人员主要运用了表面天平、荧光光谱、表面活性物质吸附积累测试(SAAT)、铺展表面天平、压缩-扩张等温线、俘获气泡表面张力测定(CBS)和差示扫描量热法(DSC)等技术手段，对猪支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage, BAL)来源的天然表面活性物质(NS)和人羊水表面活性物质(amniotic fluid surfactant, AFS)进行了系统分析。NS样本通过密度梯度超离心从猪肺BAL中纯化获得，AFS则通过程序化剖宫产从足月产妇羊水中非侵入性收集。

4.1. 荧光光谱

通过荧光探针FM1-43检测发现，未暴露于HA的NS膜能产生最大荧光，表明有较大的外表面可供探针结合。HA的存在显著降低了磷脂依赖的荧光增加，表明聚合物诱导了膜重组，可能包括囊泡聚集，减少了探针可及的表面比例。有趣的是，从预暴露样品中去除HA并不能逆转聚合物效应，表明聚合物促进的重组是永久性的。HA对NS膜的这种永久性效应使其接近AFS复合物的FM1-43可及性，而AFS材料已被发现具有最大包装和脱水状态。

4.2. 界面吸附

通过表面活性物质吸附积累测试(SAAT)和Wilhelmy天平两种技术评估了NS膜在气-液界面的吸附能力。SAAT实验显示，AFS在界面处材料积累的初始速率最大，NS在较长时间后也能达到平衡值。HA的存在似乎损害了NS到达和积累于界面的能力，可能是由于聚合物引起的粘度变化和随之而来的扩散限制。去除HA后，NS再次能够到达界面，甚至比从未暴露于聚合物的NS初始速率更快。Wilhelmy天平实验直接测量表面张力变化反映了HA的类似效应，AFS在这些实验中也显示出最大吸附能力和表面压力增加能力。

4.3. 界面铺展

通过特殊设计的具有曲折路径的铺展槽评估了不同表面活性物质样品在吸附到界面后的铺展能力。NS在供体槽中吸附到接近10 mN/m的压力，然后随着受体槽中表面压力开始增加而衰减。暴露于HA的NS样品在供体槽中吸附到更高压力(9.7 ± 0.5 mN/m)，并在受体槽中产生更早的压力增加，滞后时间比无HA时更短(138秒)。这意味着HA在NS复合物中诱导的重组产生了一种更有效的材料，不仅在吸附方面，在界面铺展方面也是如此。值得注意的是，去除聚合物后，这种由HA诱导的活化作用仍然保持。

4.4. 压缩-扩张等温线

通过表面天平获得的不同样品在界面形成的膜的循环压缩-扩张等温线显示，未暴露于HA的NS显示出在45 mN/m处的明显平台，表明材料在界面处的重组。暴露于HA使NS在45 mN/m处出现的排除平台减少了约20%，并且在后续循环中重叠，意味着由HA促进重组的材料形成的膜需要较少的重组就能维持最高压力，而且在压缩-扩张循环间，较少的材料损失到体相中。相比之下，AFS膜产生的循环等温线滞后性较小，表明复合物在界面处的重组有限，循环间材料损失较少。

4.5. 俘获气泡表面张力测定

初始吸附(IA)和扩张后吸附(PEA)实验显示，暴露于HA使NS在5分钟吸附后达到的最小表面张力从25-27 mN/m降低到约23 mN/m。有趣的是，从NS样品中去除聚合物后，达到较低表面张力的能力仍然保持。准静态循环显示NS膜在第一个循环就将表面张力降至非常低的值，存在一定滞后性，可能与界面处材料的重组有关。在存在HA的情况下，NS膜也能产生非常低的表面压力，但所需的面积减少更大，导致第一个循环的滞后性更大。动态循环中，所有样品在类似于呼吸的压缩速率下都表现出最佳行为，即达到小于3 mN/m的最小表面张力且面积减少小于20%。

4.6. 热变转变

差示扫描量热法(DSC)分析显示，NS膜具有特征性的热变行为，有一个宽阔且不对称的有序-无序转变。HA对NS热变行为有显著影响，一旦与NS相互作用，转变焓从约3增加到4 Kcal/mol以上，T_m略微向更高温度移动(从30到31°C)。去除聚合物后，焓值恢复到原始NS值，但T_m仍然显著高于未暴露于HA的NS，表明HA暴露诱导的一些结构转变是不可逆的。

研究表明，HA能诱导NS膜结构重组，形成更紧密的脱水状态，显著增强其界面吸附、铺展能力和抗失活稳定性。这种增强效应即使在去除HA后仍然持续存在，表明聚合物诱导的结构变化是永久性的。HA对PS的增强作用使其功能更接近从未暴露于气-液界面的新鲜分泌表面活性物质(AFS)的性能，尽管AFS仍表现出更优的性能。

这些发现对于开发新型高效的临床PS制剂具有重要意义。通过简单的预孵育步骤，利用HA对PS进行预处理，即使后续去除聚合物，也能获得性能增强的PS制剂，这避免了聚合物本身可能带来的粘度问题。这种策略为开发新一代临床PS制剂提供了新思路，特别是对于治疗那些目前SRTs效果不佳的呼吸系统疾病，如ARDS和胎粪吸入综合征等具有重要价值。

研究结果表明，将HA作为添加剂或预处理剂，可以显著改善现有PS制剂的性能，提高其治疗效果。这为开发更加高效、稳定的临床PS制剂指明了方向，有望为难治性呼吸系统疾病患者带来新的治疗希望。