结核分枝杆菌二氢吡啶二羧酸合酶与丙酮酸复合物晶体结构揭示其变构调控新机制

　　本研究解析了结核分枝杆菌二氢吡啶二羧酸合酶（MtDapA）与底物丙酮酸复合物的1.5??高分辨率晶体结构，通过结构分析与生物物理实验（DSF/ITC）证实MtDapA不受赖氨酸或mDAP变构调控，为针对结核病关键靶点的抑制剂设计提供了重要结构基础。

　　

Highlight

通过晶体学实验，我们解析了结核分枝杆菌DapA（MtDapA）与其底物丙酮酸形成的复合物结构，分辨率高达1.5??。丙酮酸通过希夫碱（Schiff base）与催化赖氨酸（Lys171）共价结合。结构分析揭示了活性位点氨基酸残基与丙酮酸的相互作用网络，为理解该分子的结合模式提供了新视角。

Biophysical screening

为探究MtDapA是否受细菌赖氨酸生物合成中间体或类似物的生物物理扰动，我们进行了差示扫描荧光法（DSF）实验。结果显示MtDapA的熔解温度（T_m）约为80?°C，与既往研究一致。我们测试了七种可能改变MtDapA熔解点的化合物：丙酮酸（底物）、L-赖氨酸、mDAP、草酰乙酸、琥珀酸、L-丙氨酸和L-天冬氨酸。有趣的是，仅丙酮酸引起了T_m的显著变化（ΔT_m = +3.5?°C），其他化合物均未引发明显热稳定性改变（图2A）。

Isothermal Titration Calorimetry (ITC)

通过等温滴定量热法（ITC），我们直接评估了MtDapA与丙酮酸、L-赖氨酸和mDAP的结合亲和力。实验证实丙酮酸与MtDapA结合的解离常数（K_d）为29.9?μM（图2B），而L-赖氨酸和mDAP在最高测试浓度下仍未观察到结合信号（图2C-D），表明MtDapA对这些代谢产物缺乏亲和力。

Overall structure of MtDapA in complex with pyruvate

MtDapA-丙酮酸复合物结构以1.5??分辨率解析（PDB ID: 8P2R），显示该酶为同源四聚体（图3A）。每个单体包含典型的TIM桶催化核心和C端α-螺旋结构域。丙酮酸分子清晰地位于活性中心，与Lys171形成共价希夫碱连接（图3B）。关键活性残基（Thr54, Thr55, Tyr143, Arg148）与丙酮酸形成氢键网络，稳定其结合构象（图3C）。

Discussion

与革兰阴性菌同源酶（如EcDapA）不同，MtDapA缺乏保守的赖氨酸变构结合位点（如Asn残基缺失），这解释了其为何不受赖氨酸或mDAP的变构抑制。这种调控机制的差异可能反映了结核分枝杆菌在宿主环境中适应性的进化策略。

Conclusion

本研究提供了MtDapA与丙酮酸结合的高分辨率结构蓝图，揭示了其独特的活性位点构象和缺乏变构调控的特性。这些发现为针对结核病病原体的特异性抑制剂设计提供了关键结构见解，有望推动新型抗结核药物的开发。