远程皮肤与血液采样技术在结缔组织病转化研究中的可行性验证及分子标志物发现

　　本刊推荐：为解决地理和行动障碍导致的结缔组织病研究参与难题，研究人员开展了远程皮肤胶带剥离（tape stripping）和Tasso毛细血管血采集技术的可行性研究。研究成功优化了RNA提取流程，并通过微阵列和蛋白质组学分析，在狼疮和硬斑病样本中鉴定出CXCL9、CCR6、PDGFRA等关键分子标志物的表达上调，证实了远程采样技术在分子分型中的应用潜力，为扩大罕见病患者参与转化研究提供了可扩展模型。

　　

在罕见病临床研究领域，地理障碍和医疗资源分布不均始终是难以逾越的鸿沟。最新数据显示，早期临床试验在社区环境中普遍缺失，导致农村地区的临床试验参与率显著低于城市中心。更令人担忧的是，距离临床中心的遥远路程对 underrepresented populations（代表性不足群体）造成了不成比例的影响——农村和南部居民、美洲原住民、黑人和公共保险人群面临更长的就诊时间，这直接限制了他们的研究和医疗机会。皮肤科和罕见病专业知识的匮乏进一步加剧了农村医疗的困境，使得许多患者无法获得及时诊断和治疗。

以皮肤型红斑狼疮（CLE）和硬斑病（morphea）为代表的自身免疫性皮肤病正是这一现状的缩影。这两种罕见、慢性疾病不仅治疗选择有限，诊断还经常被延误。在CLE中，羟氯喹和皮质类固醇仍然是仅有的FDA批准疗法，而超过60%的硬斑病患者经历超过6个月的诊断延迟，治疗往往依赖经验性方案。疾病的罕见性加上地理分布带来的招募挑战，直接拖慢了生物标志物和治疗靶点的验证进程。

正是在这样的背景下，马萨诸塞大学医学院皮肤科的研究团队在《JID Innovations》上发表了一项开创性研究，探索通过远程、非侵入性生物样本采集方法突破这些障碍。他们巧妙地将非侵入性皮肤胶带剥离（tape stripping）技术与Tasso毛细血管血采集设备相结合，通过邮寄采样套件的方式，实现了对狼疮和硬斑病的分子分析。

研究人员首先从5名健康捐赠者身上优化了皮肤胶带剥离采样和RNA提取方案。他们比较了四种不同的提取方法，发现室温下刮取胶带条而不使用冰浴的方法（Method A）能够获得最高浓度和质量的RNA。尽管胶带条的A260/280比值更接近FFPE RNA（福尔马林固定石蜡包埋RNA）而非新鲜RNA，但这并不影响后续分析。基于这一优化方案，研究团队成功招募了8名狼疮患者（包括3名SLE、4名SLE/CLE、1名DLE）、3名硬斑病患者和8名健康对照。

关键技术方法包括：使用22 mm D-Squame标准胶带盘进行皮肤采样，每个部位连续采集20条胶带；通过Tasso+血液采集设备进行远程自采血；使用Qiagen RNEasy Micro试剂盒进行RNA提取；采用NanoString人类髓系v2微阵列进行转录组分析；使用Olink Proteomics免疫肿瘤学panel进行血清蛋白质组学检测。

远程采样

研究通过IRB批准的方案进行，参与者通过Zoom指导或现场活动完成采样。采样套件包含20条胶带条和Tasso+血液采集设备，通过优先隔夜运输返回实验室。血清通过330g离心5-10分钟收集，胶带条则立即处理以防止RNA降解。

胶带条RNA提取

研究人员测试了四种RNA提取方法，最终选择Method A（室温刮取不加冰）作为标准方法。该方法在5名健康捐赠者中表现出最佳的RNA回收率，平均浓度为2.636 ng/μL，尽管A260/A280比值较高（3.764），这被归因于胶带粘合剂和其他基质成分的干扰。

微阵列转录组学

使用NanoString人类髓系v2微阵列分析胶带条RNA，数据通过nSolver分析软件处理，应用低计数 cutoff为10和自动探针标准化。差异表达分析通过GraphPad Prism软件v10创建的火山图进行可视化。

血清蛋白质组学

血清样品在UMass Chan Integrated Biomarkers Core facility使用Olink Proteomics免疫肿瘤学panel进行分析。原始蛋白质丰度数据使用Olink Analyze R包处理和标准化，提供基于Cq值的标准化蛋白表达（NPX）值，这些值经过log2转换。

结果与讨论

微阵列分析发现，与健康对照相比，狼疮皮肤胶带中CXCL9、CCR6、FGF10、EPHB6、PDGFRA、COL10A1和MSC等基因表达显著上调。蛋白质组分析显示，狼疮血清中TNFRSF4、ANGPT2和IFN-γ水平升高，而IL-13表达低于对照组。

硬斑病样本与健康对照比较显示PDGFRA、P2RX1、CCR6、KALRN、FGF10、DES、NOD1、RAD51、CCL16、PDGFA、ADGRE5、MERTK、CEACAM8、C1QA、KCNAB1、SESN1和FZD4等基因显著富集。TNFRSF1B是唯一在健康皮肤胶带中显著富集的基因。

值得注意的是，研究还发现狼疮和硬斑病之间存在明显的基因表达差异：CTGF、TNFRSF4和MAFB在狼疮皮肤中显著富集，而ALOX15、KALRN和P2RX1在硬斑病皮肤中显著富集。

为了验证这些发现的可靠性，研究人员将差异表达基因（DEGs）和差异表达蛋白（DEPs）与公开数据集进行比较，发现CXCL9和IFN-γ在多个数据集中均得到证实，包括Merola等人的胶带剥离研究、GSE95474皮肤RNAseq数据、GSE112943存档皮肤微阵列数据以及GSE182300/182301水泡液Olink数据。

在狼疮患者中，研究人员观察到皮肤中CXCL9 mRNA表达和血清中IFN-γ蛋白表达的上调。IFN-γ诱导IFN诱导性趋化因子包括CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达。这些经典干扰素调节趋化因子的升高在CLE皮损皮肤的转录组和免疫组化研究中得到一致证实。

特别有趣的是，P2RX1和KALRN能够区分硬斑病与健康和狼疮样本，这可能成为通过远程采样识别硬斑病的有用生物标志物。值得注意的是，P2RX1、KALRN和MAFB此前未在狼疮或硬斑病皮肤的转录组研究中被报道过，可能代表疾病特异性标志物。CCR6、PDGFRA和FGF10表达在两种结缔组织病中均升高，这可能有助于区分这些疾病与其他临床实体。

研究局限与意义

该研究存在几个局限性：小样本队列、随后使用的原始P值cutoff、RNA和蛋白质分析的靶向panel以及缺乏纵向随访。另一个限制是缺乏临床医生确认的狼疮诊断——虽然狼疮参与者报告了长期疾病或诊断，但未使用医疗记录或医生评估来验证诊断标准。

尽管如此，这项研究证明了远程皮肤胶带条和血液采样用于结缔组织病分子分析的可行性。这些方法有助于弥合可及性差距，促进转化皮肤病学研究的参与，并且可以在多个队列中扩展和测试，以验证不仅用于区分疾病状态，还用于评估疾病活动性和治疗反应的生物标志物。

研究人员在讨论中指出，需要进一步的研究来在更大的患者队列中确认这些生物标志物，并进行机制研究以确定这些基因和蛋白质在狼疮和硬斑病发病机制中的任何生物学作用。CXCL9和IFN-γ的上调与现有CLE数据集高度一致，这些数据集强调ISGs（干扰素刺激基因）作为核心疾病标志物。相反，经典的促纤维化基因如CTGF和PDGFRA通常与真皮重塑相关，在之前使用胶带条的CLE转录组研究中并未显著检测到。

这些生物标志物可能在早期硬斑病中特别有用，在早期病变中，即使没有全层组织受累，真皮-表皮串扰可能短暂地升高纤维化标志物。这一假设得到了硬斑病皮肤基因表达谱的支持，在早期病变中，干扰素反应基因和轻度纤维化信号共存。

这项概念验证性试点研究表明，远程RNA和蛋白质分析是可行的，并且可重复地识别经典的和此前未报告的疾病标志物。这种方法能够更广泛地纳入服务不足的患者，并为皮肤病学和自身免疫研究中的远程生物标志物研究提供可扩展模型。随着远程医疗技术的不断发展，这种创新采样方法有望彻底改变罕见病和自身免疫性疾病的研究格局，为那些长期被忽视的患者群体打开参与临床研究的大门。