方酸二丁酯通过诱导CD206+巨噬细胞积聚促进先天性免疫驱动的毛发生长机制研究

　　本研究针对斑秃（AA）治疗中免疫调节机制不明的难题，探讨了方酸二丁酯（SADBE）通过诱导先天性免疫反应促进毛发生长的新机制。研究人员发现SADBE单次应用即可通过募集CD206+巨噬细胞至真皮层并形成分层结构，直接激活毛囊进入生长期，且该过程不依赖适应性免疫。该研究为开发靶向巨噬细胞的斑秃治疗策略提供了重要理论依据。

　　

斑秃（Alopecia Areata, AA）是一种自身免疫性皮肤疾病，患者会出现局部或全身性的毛发脱落，严重影响生活质量。当前治疗方法中，局部免疫疗法如使用方酸二丁酯（Squaric Acid Dibutylester, SADBE）可通过诱导接触性皮炎（Allergic Contact Dermatitis）促进毛发生长，但其具体作用机制长期以来并不明确。特别是在SADBE治疗过程中，免疫细胞如何被招募、分化以及如何直接作用于毛囊干细胞和真皮乳头细胞（Dermal Papilla Cells）等问题尚未得到深入解析。

为探究SADBE诱导毛发再生的机制，研究团队以自发罹患斑秃的C3H/HeJ小鼠为模型，并同步在健康年轻小鼠中开展对照实验。研究人员发现，无论是斑秃模型还是健康小鼠，外用SADBE均能显著促进毛发生长，且该效应最早在施用后第14天（健康鼠）或第28天（AA鼠）显现。组织学分析显示，处理组皮肤中毛囊提前进入生长期（Anagen），而对照组则维持在休止期（Telogen）。进一步通过连续取样和高分辨率免疫荧光染色发现，SADBE施用后第3天，真皮中出现了大量巨噬细胞聚集，并可根据表面标志物分为三种亚群：CD206⁺F4/80^–、CD206⁺F4/80⁺和CD206^–F4/80⁺细胞。尤其值得注意的是，CD206⁺F4/80⁺细胞密集分布于真皮乳头区域，紧邻毛囊结构，暗示其可能通过旁分泌作用激活毛囊干细胞。

为验证巨噬细胞在毛发再生中的必要性，研究者使用氯膦酸盐脂质体（Clodronate Liposomes, CLL）局部注射以清除真皮中的巨噬细胞。结果显示，巨噬细胞缺失组中SADBE诱导的毛发生长被显著抑制，组织切片中毛囊未能进入生长期，证实巨噬细胞是SADBE发挥作用的关键细胞类型。此外，无论是省略腹部致敏步骤还是仅单次背部施用SADBE，均可诱发类似的毛发生长效应，表明这一过程并不依赖于T细胞介导的适应性免疫反应，而是由先天性免疫细胞（尤其是巨噬细胞）驱动的急性炎症所介导。

在AA模型鼠中，重复施用SADBE可逐渐增加真皮中CD206⁺巨噬细胞的数量，并与毛发再生进程高度相关。相比之下，斑秃患鼠皮肤中虽存在大量CD206^–F4/80⁺炎症性巨噬细胞，但在SADBE处理下这些细胞并未显著增加，而CD206⁺细胞则呈现持续上升趋势，说明SADBE可能通过调控巨噬细胞极化状态，使其向具有修复功能的M2型（CD206⁺）转化，进而促进毛囊再生。

该研究综合运用了组织学检测（H&E染色）、多重免疫荧光染色、流式细胞术分析和细胞剔除实验等技术手段。样本来自C3H/HeJ小鼠的背部皮肤组织，通过酶消化法分离细胞并进行表面标志物（CD206、F4/80、Ly-6C、Ly-6G、CD3、CD4、CD8等）染色。图像定量分析采用ImageJ软件，统计方法包括方差分析与曼－惠特尼U检验。

Effect of SADBE on hair growth induction in AA and healthy mice

研究证实，在AA模型和健康C3H/HeJ小鼠中，局部施用SADBE均可有效诱导毛发生长。AA鼠需重复处理至第28天才出现显著生发效果，而健康鼠在第14天即有明显反应，说明SADBE在无自身免疫干扰的环境中起效更快。

Changes in skin tissue and hair follicles after SADBE application

每天的组织学监测发现，SADBE施用后第1天即出现显著水肿与白细胞浸润，第5天毛囊开始增粗并进入生长期，证实炎症反应先于毛囊形态变化发生。

SADBE application induces the accumulation of characteristic macrophages in the dermis

免疫荧光结果显示，第3天真皮层中出现大量F4/80⁺和CD206⁺巨噬细胞，形成三种亚群，其中CD206⁺F4/80⁺细胞紧靠毛囊乳头区域。

Stratified distribution of macrophage subsets in the dermis

巨噬细胞亚群在真皮内呈分层分布：CD206⁺F4/80^–细胞集中于真皮上层，CD206⁺F4/80⁺位于真皮乳头区，CD206^–F4/80⁺则分布于真皮乳头与脂肪层交界处。

Macrophage depletion inhibits SADBE-induced hair growth

通过CLL剔除巨噬细胞后，SADBE无法诱导毛发生长，证明巨噬细胞是必要媒介。

Adaptive immune response is dispensable for SADBE-induced hair growth

省略致敏步骤或仅单次施用SADBE仍可诱导毛发生长，且早期（第3天）皮肤中未见T细胞显著浸润，表明该过程不依赖适应性免疫。

Repeated SADBE application to AA mice increases CD206⁺ macrophages

在AA鼠中重复施用SADBE可逐渐增加CD206⁺巨噬细胞数量，并与毛发再生同步发生，提示其在疾病调控中具核心作用。

本研究首次揭示SADBE通过诱导CD206⁺巨噬细胞在真皮中分层积聚，从而直接激活毛囊进入生长期，该过程依赖先天性免疫而非传统认为的T细胞反应。这一发现不仅深化了对斑秃免疫治疗机制的理解，也为开发新型巨噬细胞靶向疗法提供了理论依据。研究结果发表于《JID Innovations》，为临床转化提供了重要实验基础。