基于整体阴离子交换色谱技术高效分离血小板细胞外囊泡与脂蛋白污染物的策略研究

　　本文系统评估了四种整体阴离子交换色谱柱（CIMmultus QA/DEAE、ProSwift SAX-1S/WAX-1S）对血小板细胞外囊泡（pEV）的纯化效能，在实现60–80% pEV回收率与1.5-5.4×1011 particles/A280高纯度指标的同时，显著清除脂蛋白污染物。研究通过优化洗脱条件与缓冲液添加剂（如尿素、Tween 20），为血液来源EV的规模化生产提供了关键技术支撑。

　　

Strong quaternary amine anion-exchange column separates lipoproteins from pEVs

通过比较四种适用于大生物分子和病毒颗粒纯化的整体阴离子交换色谱柱（详见表1），利用含pEV的血小板上清液进行分离效能评估（图1）。将血小板上清液在含100 mM NaCl的缓冲液A（见表2）中上样，并采用100 mM至2 M的线性NaCl梯度进行洗脱。色谱图起始端出现明显峰型，对应流穿组分，该组分主要由未结合的脂蛋白构成。随后在更高盐浓度下洗脱出pEV，表明其与阴离子交换柱之间存在特异性相互作用。

所有测试色谱柱均成功实现pEV与脂蛋白的分离，但洗脱模式存在差异。CIMmultus QA柱（强阴离子交换型）在pEV洗脱前额外产生一个脂蛋白洗脱峰，暗示该树脂对脂蛋白亚群具有更高分辨力。通过纳米颗粒追踪技术（NTA）与紫外吸光度（A₂₈₀）检测，计算得到特异性颗粒-蛋白比值（1.5–5.4 × 10¹¹ particles/A₂₈₀），且pEV回收率达60–80%。透射电镜（TEM）图像证实洗脱组分的囊泡形态完整性，而蛋白印迹（Western blot）显示EV标志物CD9、CD63和磷脂酰丝氨酸结合蛋白Annexin V呈阳性，同时脂蛋白标志物ApoB100未被检出。

基于CIMmultus QA柱对脂蛋白的高效去除能力，本研究选择该柱进行后续条件优化。通过引入替代反离子（如硫酸根、柠檬酸根）及减少非特异性结合的缓冲添加剂（包括尿素、Tween 20、CHAPS与肝素），评估其对pEV回收率的提升效果。实验发现，添加1 M尿素或0.01% Tween 20可轻微提高pEV产量，而其他添加剂未显显著改善。

Conclusions

血站提供的非临床富余血小板浓缩物为pEV分离提供高质量标准化原料，但EV与无细胞上清液的分离仍具挑战。脂蛋白一直是血液来源EV纯化的技术难点，目前尚无简便且可规模化的解决方案。基于电荷分离原理的离子交换色谱法（而非依赖尺寸分离）近年备受关注，本研究通过系统性优化色谱条件与缓冲体系，为开发规模化pEV生产平台奠定基础，并有望实现基于生物物理特性的EV亚群选择性分离。