基于AKT/mTOR通路探究红景天苷改善缺氧诱导的奶牛乳腺上皮细胞乳合成障碍及内质网应激的机制

　　本研究聚焦日本传统汉方药膏（Kampo ointments）的伤口愈合潜力，针对其脂溶性成分研究匮乏的现状，结合民族药理学调查、非靶向代谢组学（LC-HRMS/MS）和体外细胞模型（N/TERT-2G keratinocytes scratch assay, EdU assay），系统分析了不同制备温度（Maceration, Low Heating, High Heating）和药材来源对紫云膏（Shiunkō）与神仙太乙膏（Shinsen taitsukō）化学成分及其对角质形成细胞迁移与增殖的影响，揭示了传统制备工艺的复杂性及其对药效物质基础与生物活性的重要影响，为科学阐释与开发传统脂溶性草药制剂提供了新视角。

　　

在传统医学的宝库中，日本汉方医学（Kampo）占有独特地位，其不仅是古代中医与日本民间医学融合的结晶，更发展出了丰富的外用制剂形式。其中，以芝麻油为基质提取草药制成的药膏，如紫云膏（Shiunkō）、中黄膏（Chuōkō）和神仙太乙膏（Shinsen taitsukō），几个世纪以来一直被用于治疗皮肤创伤、促进伤口愈合。然而，与已被广泛研究的水溶性或醇溶性植物提取物不同，这些基于芝麻油的脂溶性草药提取物的化学成分及其伤口愈合功效在很大程度上仍是一片未被探索的“蓝海”。其制备方法在成分、植物种类、提取温度和时长上存在显著差异，导致了配方的多样性，也使得其药效物质基础和质量控制面临巨大挑战。

为了填补这一知识空白，并探索这些传统外用制剂中脂溶性植物代谢物的潜在贡献，一个由Manon Paul-Traversaz、Kaoru Umehara、Kenji Watanabe等多国学者组成的研究团队开展了一项综合性研究。他们的研究成果发表在《Journal of Ethnopharmacology》上，系统地揭示了不同制备工艺和药材来源对汉方药膏化学组成及生物学活性的深刻影响。

研究人员综合运用了民族药理学调查、化学分析与生物学评价等多种手段。首先，他们通过对日本医生、药剂师和药材生产商的访谈，详细记录了与伤口愈合汉方药膏相关的实践，重点突出了提取方案、生药起源和制造实践方面的差异。在此基础上，他们选取了紫云膏和神仙太乙膏作为研究对象，严格按照传统工艺制备了不同温度（室温浸渍M、80°C低温加热LH、200-230°C高温加热HH）下的芝麻油对照、单味药提取物（如当归）和全方提取物。样本制备时排除了蜂蜡等固体成分，并针对代谢组学和生物学研究采用了不同的溶剂处理。化学分析方面，采用液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）和液相色谱-串联质谱（LC-HRMS/MS）进行非靶向代谢组学分析，以解析不同制备温度和植物来源对提取物成分的影响。生物学评价则采用体外实验，通过划痕实验（scratch assay）评估角质形成细胞迁移能力，通过EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）掺入实验检测细胞增殖活性，并运用适当的统计方法进行数据评估。

研究结果丰富而具启发性：

3.1. Defining Kampo extracts

通过民族药理学调查，明确了所研究的汉方药膏及其制备方法。重点聚焦于紫云膏和神仙太乙膏，并详细记录了其成分（见表3）和三种核心提取温度方案：浸渍（M）、低温加热（LH）和高温加热（HH），其具体流程见图1。

3.2. Characterising the implications of heating sesame oil

研究发现，芝麻油本身（不同加热处理的对照组）在角质形成细胞划痕实验中并未表现出促迁移或促增殖的显著生物效应（图2，图S1）。然而，代谢组学分析（PCA，图3）表明，加热条件和芝麻油批次显著影响了其代谢物谱。高温加热（SHH, CHH）导致游离脂肪酸（如亚油酸M279T744、油酸M281T768）含量增加，而植物甾醇（如谷甾醇M437T881）、生育酚（如δ-生育酚M403T852）和某些甘油酯（如单硬脂酸甘油酯M381T706）则因高温而降解或含量减少（图4）。分子网络分析（图5）进一步揭示了高温加热下特有的脂质转化产物，如单酰基甘油（MAGs）、二酰基甘油（DAGs）以及可能的美拉德反应产物（MRPs）和氧化脂质。

3.3. Impact and influences of A. acutiloba root in Kampo ointments

研究发现，单独的白芷（Angelica acutiloba）油提物（S1M, S1LH, S1HH, T1M1, T1LH1）与其相应的芝麻油对照相比，在角质形成细胞迁移模型中并未显示出差异化的生物效应（图6）。然而，化学分析表明，白芷的加入可能抑制了高温加热芝麻油中氧化脂质的形成（图7）。更重要的是， multivariate统计分析（PCA, PLS-DA, 图8）和Biosigner分析表明，加热温度是导致代谢物差异的最主要因素，而白芷的地理起源和加工方式（如 blanching）也影响了其代谢物谱，特别是与伤口愈合相关的糖基化萜类化合物（如M621T786，图9）的含量。

3.4. Comparative exploration of complete Kampo formulas compared to A. acutiloba extracts

令人意外的是，与单味药提取物相比，完整的汉方药膏配方（紫云膏S6HH和神仙太乙膏TMO）在划痕实验中反而延迟了角质形成细胞的伤口闭合（图10）。通过Biosigner等分析工具，研究人员推测紫云膏全方的延迟效应可能与其中具有潜在促进愈合作用的醌/氢醌类脂质（如维生素E类似物，M415T773, M431T786）在复方环境中含量降低有关（图11）；而神仙太乙膏的效应则可能与其特有的酯化二萜类化合物（M377T648）或其他复方中新增药材（如大黄中的蒽醌、芍药中的单萜苷）的引入有关（图12）。这提示复方中各草药成分间可能存在复杂的相互作用，影响了最终的整体生物活性。

讨论与结论

本研究强调了传统汉方药膏在化学成分和生物活性方面的多样性与复杂性。制备温度和药材来源显著塑造了代-谢物谱，既影响了新的亲脂性化合物的形成，也导致了与愈合相关代谢物（如生育酚、甾醇）的降解。更高的加热温度和更长的提取时间促进了改性脂质化合物的形成和生物活性代谢物（如生育酚和甾醇）的损失。同时，白芷的植物来源影响了与伤口愈合相关的糖基化萜类化合物的数量。完整的配方在体外单层模型中降低了角质形成细胞的迁移速度。靶向代-谢组学表明，紫云膏中维生素E类氢醌脂质的损失和神仙太乙膏中酯化二萜的存在可能是其原因。这些观察结果的直接临床相关性仍不确定。

这些结果强调了对生药油性提取物进行深入研究的必要性，这方面目前仍未得到充分探索。对传统汉方药膏的研究可能会受益于一种更综合的方法，即将代谢组学与创新的生物学模型相结合，以便更好地阐明它们在伤口护理中的治疗应用。尽管当前单一的角质形成细胞模型未能完全捕捉到这些复杂脂质制剂可能具有的促进愈合活性（可能包括抗炎等方面），但本研究为理解传统制备工艺的“黑箱”提供了宝贵的化学见解，为未来优化汉方药膏质量标准和探究其科学内涵奠定了坚实基础。