基质刚度独立于TGF-β调控成纤维细胞表型依赖性收缩力与迁移行为的作用机制研究

　　本研究针对伤口愈合过程中成纤维细胞表型转化（FMT）的力学调控机制展开，通过整合形态计量学、牵引力显微镜和单细胞迁移分析技术，发现基质刚度在调控成纤维细胞形态、力生成和迁移行为中起决定性作用，甚至超越经典TGF-β信号通路的影响。该研究揭示了组织刚度作为成纤维细胞行为的关键力学生物学调节因子，为靶向力学微环境调控组织修复提供了新思路。

　　

在伤口愈合过程中，成纤维细胞（fibroblasts）经历了一系列复杂的表型和行为变化。它们被激活、募集到损伤部位、转化为具有收缩能力的肌成纤维细胞（myofibroblasts），并分泌细胞外基质（ECM）蛋白以协调组织修复。这一过程涉及细胞骨架组装与组织、黏附形态和力生成的动态变化。与此同时，成纤维细胞在组织损伤和修复过程中还会经历环境刚度的变化。尽管已知细胞通常利用其黏附-收缩 machinery 感知微环境刚度，但刚度如何影响成纤维细胞在伤口愈合中的表型转变和行为仍知之甚少。

近年来，越来越多的证据表明，成纤维细胞表型在多个调控水平上受到机械力的调节。例如，成纤维细胞和肌成纤维细胞以闭合、无活性的构象产生和释放TGF-β，并将其嵌入ECM中形成大型潜伏复合物。当细胞对ECM施加力时，TGF-β构象发生变化，使其能够与成纤维细胞膜受体结合，从而诱导FMT并产生更多TGF-β，形成正反馈循环。此外，在激活状态下，成纤维细胞通过提升基质金属蛋白酶（MMPs）的分泌降解ECM，向组织 disruption 部位迁移。细胞迁移需要主动的力生成和细胞骨架重排，这些过程影响着细胞和ECM的力学特性。

值得注意的是，在细胞水平上，同一套细胞内 machinery 负责不同的细胞过程，如表型转变、迁移和力学感知。细胞力由肌动蛋白-肌球蛋白应力纤维产生，并通过黏着斑（FAs）传递到ECM。肌动蛋白-肌球蛋白应力纤维对于感知微环境线索和促进细胞迁移至关重要，而FAs使细胞能够探测成纤维细胞的物理环境。已有研究表明，物理线索（如接触引导）可通过影响FAs的形态、组织和定位来改变成纤维细胞行为，从而导致细胞骨架组织的变化。事实上，FA形态与细胞牵引力密切相关，而牵引力又与细胞动力学（如迁移）相关。例如，较强的牵引力通常与较慢的细胞迁移相关。这一点对成纤维细胞尤为重要，因为在伤口愈合过程中，真皮成纤维细胞需要对ECM施加力以迁移和收缩，从而闭合伤口。

尽管这一复杂的多层面调控的许多方面已得到单独研究，但目前尚无全面的框架来研究和理解成纤维细胞表型、迁移、细胞与ECM力学以及细胞形态之间的相互作用，尤其是在FMT的背景下。因此，本研究旨在探究基质刚度如何在FMT过程中调控成纤维细胞表型，并阐明其是否独立于TGF-β介导的刺激。

为了回答这些问题，研究人员开展了一项系统性的实验研究，结合了人真皮成纤维细胞（nhDFs）培养、聚丙烯酰胺（pAA）水凝胶制备、荧光染色与成像、单细胞迁移分析、牵引力显微镜（TFM）以及自动化图像分析等技术。细胞培养在玻璃和pAA水凝胶上，刚度分别设置为9 kPa（模拟健康组织）和30 kPa（模拟病理组织），并在48小时和96小时时间点进行分析。通过使用TFM测量细胞施加的力，并利用自定义算法分析细胞迁移轨迹和FA形态。

研究结果表明，基质刚度在决定成纤维细胞表型方面起着决定性作用，甚至超过了经典的TGF-β介导的刺激。形态计量分析、牵引力显微镜和单细胞迁移分析显示，环境刚度引导了成纤维细胞的细胞骨架和力学响应，强烈调节了其形态、力生成和迁移行为。具体来说，在软基质（9 kPa）上，成纤维细胞表现出稀疏的F-肌动蛋白束和少量小型黏着斑，即使添加TGF-β，也未能显著促进αSMA（alpha-smooth muscle actin）融入应力纤维。而在硬基质（30 kPa）上，成纤维细胞形成了更密集的细胞骨架网络和更多的FAs，TGF-β的添加进一步诱导了αSMA融入F-肌动蛋白应力纤维，表明完全分化为肌成纤维细胞。

在迁移行为方面，研究发现刚度感知调节了成纤维细胞的迁移特性。在软水凝胶上，成纤维细胞迁移速度较低（0.32 ±0.22 μm/min），而在硬水凝胶上速度较高（0.56 ±0.29 μm/min）。TGF-β处理在硬基质上降低了迁移速度，表明细胞向更静止的肌成纤维细胞表型转变。牵引力分析显示，软基质上的牵引力较低（101.3 ±51.6 Pa），而硬基质上的牵引力较高（270.5 ±168.6 Pa）。TGF-β在软基质上增加了牵引力，但在硬基质上略微降低，这与FA稳定性和细胞收缩性的变化一致。

FA形态分析进一步揭示，硬基质上的FAs更 elongated（偏心度更高），TGF-β处理进一步促进了这一现象，而软基质上的FAs则更圆形，且TGF-β处理无显著影响。这表明基质刚度通过调节FA成熟和细胞骨架组织来影响细胞表型和行为。

本研究通过多方面的实验分析，揭示了基质刚度在成纤维细胞表型转化和迁移行为中的核心作用。研究结论强调，组织刚度是成纤维细胞行为的关键力学生物学调节因子，其影响甚至超越了TGF-β等生化信号。这一发现为理解伤口愈合和纤维化等病理过程中的细胞响应提供了新视角，突出了靶向力学微环境作为控制组织修复策略的潜力。此外，研究还表明，αSMA的表达水平并不直接对应细胞表型，其融入应力纤维的程度才是区分成纤维细胞和肌成纤维细胞的关键功能指标。这些 insights 不仅深化了对FMT机制的理解，还可能为开发针对力学微环境的治疗策略提供理论基础。

总之，这项研究通过整合力学生物学、细胞生物学和成像技术，全面揭示了基质刚度在调控成纤维细胞表型和行为中的重要作用，为未来研究提供了新的框架和方向。论文发表在《Mechanobiology in Medicine》，为力学医学领域的进展做出了重要贡献。