加快诊断速度：直接检测阳性血液培养液中的碳青霉烯类耐药性

《Medical Journal Armed Forces India》：Accelerating diagnosis: Direct detection of carbapenem resistance in positive blood culture broth

　　检测血液培养中碳青霉烯酶基因的PCR方法更准确且缩短48小时诊断时间。

　　

Nivedha Srinivasan|Sevitha Bhat|Archana Bhat|Anna Rajan Thomas|K. Souharda

印度曼尼帕尔大学曼古洛尔校区卡斯特尔巴医学院微生物学高级住院医师

摘要

背景

本研究的目的是比较检测碳青霉烯类耐药基因的表型和基因型方法，评估这些基因在血液培养液中的直接检测效果与临床显著分离株之间的差异，并确定与碳青霉烯类耐药革兰氏阴性菌感染相关的风险因素、抗生素治疗及预后。

方法

本研究是一项基于实验室的前瞻性时间限定研究，纳入了培养出碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的血液培养样本。首先采用表型方法检测碳青霉烯类耐药性，随后通过常规聚合酶链反应（PCR）检测5种常见的碳青霉烯酶（新德里金属β-内酰胺酶、OXA-48酶、IMP酶、维罗纳整合子编码的金属β-内酰胺酶以及肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶），这些检测既针对菌落也针对血液培养瓶直接进行。

结果

表型方法的敏感性为95%，特异性为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为92.5%。血液培养液中的PCR检测敏感性为91.3%，特异性为83%，准确率为88.6%，Cohen’s Kappa值为0.84。显著的风险因素包括男性性别、年龄≥55岁且伴有并发症（如糖尿病）、使用抗生素的历史，以及在重症监护病房住院超过三天并带有留置导管。

结论

PCR方法具有更高的确定性，直接应用于阳性血液培养液时表现出良好的敏感性和高特异性，减少了假阳性结果。该方法将检测时间缩短了48小时，有助于及时实施适当的经验性治疗，从而可能降低死亡率、发病率和医疗成本。

引言

败血症是指血液中存在活跃的微生物或其毒素引起的感染，而菌血症仅表示细菌的存在。当败血症伴随器官功能障碍时称为严重败血症；若伴有难治性低血压，则发展为败血性休克。¹血流感染是一种严重的威胁，需要立即进行临床处理。

血流感染的诊断依赖于血液培养。完整的检测报告通常需要约72小时，在此期间患者可能已经接受了不合适的经验性治疗，可能导致恢复不良和住院时间延长。

在抗生素耐药性日益严重的背景下，对于高度耐药的病原体还需进行进一步检测，这可能需要额外的一天时间。

医学领域最迫切的需求是能够缩短检测时间（TAT）并提供可靠结果的诊断方法，使医生能够自信地开始适当的治疗。²血液培养结果的延迟会导致不恰当的经验性治疗（48–72小时），从而加剧抗生素耐药性的问题。因此，开发替代的抗生素耐药性检测方法对于指导及时和合适的治疗至关重要。³世界卫生组织（WHO）已将碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌列为全球优先关注的问题，因其对公共卫生的威胁日益增加。检测碳青霉烯类耐药基因有助于实施针对性治疗、合理使用抗菌药物（AMS）并更新抗生素政策。⁴

多重耐药革兰氏阴性杆菌（MDRGNB）引起的菌血症仍是医院内死亡率和发病率的主要来源。^{5, 6, 7}作为治疗MDRGNB引起的败血症的最后手段，常使用多粘菌素。最新研究表明，革兰氏阴性杆菌也开始对多粘菌素产生耐药性。⁸

根据细菌的活性和耐药潜力谨慎选择初始治疗方案可以避免后续调整治疗方案，使得早期经验性单药治疗成为理想选择。随后应根据最终的抗生素敏感性报告调整治疗方案。⁹

少数研究探讨了利用聚合酶链反应（PCR）直接从血液培养液中检测革兰氏阴性菌血流感染中的抗生素耐药基因。作为一种半自动化且成本效益高的方法，PCR为其他商业分子检测方法提供了经济可行的替代方案。¹⁰直接检测血液培养液中革兰氏阴性杆菌的碳青霉烯类耐药机制可显著缩短检测时间。本研究旨在验证PCR在阳性血液培养液中直接检测碳青霉烯酶的可行性。

如果成功，这种方法可以常规用于诊断疑似革兰氏阴性菌败血症。此外，我们还比较了检测碳青霉烯类耐药基因的表型和基因型方法，并分析了与碳青霉烯类耐药革兰氏阴性菌感染相关的风险因素、抗生素治疗及预后。

材料与方法

本研究在一家三级医疗机构进行。

研究时间为2022年8月至2024年1月，纳入了具有临床意义的非重复性血液培养样本，这些样本中含有碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌；排除的样本为培养出碳青霉烯类敏感的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的血液培养瓶。

血液培养瓶被送入自动化血液培养系统进行处理。

结果

在14个月内，共收集了88份血液培养液样本，其中直接涂片显示存在属于肠杆菌科、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的革兰氏阴性杆菌，这些细菌对碳青霉烯类药物具有耐药性或中介敏感性。

讨论

本研究重点关注从含有碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的阳性血液培养液中直接检测碳青霉烯酶。表型检测显示出较高的可靠性，而血液培养液中的PCR检测方法提供了更快的结果，具有出色的敏感性和特异性，将检测时间缩短了48小时。最常见的耐药基因包括NDM酶、OXA-48酶以及鲍曼不动杆菌中的OXA-51酶和OXA-23酶的组合。

结论

总之，在当前情况下，革兰氏阴性杆菌菌血症仍然是一个重大问题，其中碳青霉烯类耐药性普遍存在，包括全耐药菌株。mCIM方法被证明是检测耐药性的可靠工具，而直接从阳性血液培养液中进行的PCR检测方法能够更快、更准确地得出结果。通过更快地识别耐药感染，该方法有望改善临床预后、降低死亡率并提升抗菌药物的使用效率。

患者/监护人/参与者同意

不适用。

伦理审查

已获得研究所/医院的伦理审查批准。

资金支持

无。

利益冲突声明

作者无需要声明的利益冲突。

致谢

我们感谢曼尼帕尔大学在方法支持方面提供的帮助。