综述：应用除5型腺病毒以外的腺病毒进行溶瘤病毒疗法的最新进展

　　本综述系统探讨了非5型人腺病毒（非HAdV-C5）在溶瘤病毒疗法（OVs）中的前沿进展。文章重点介绍了腺病毒（Ads）的天然多样性（涵盖A-G物种）、新型基因工程技术（如同源重组HR、模块化组装）在构建嵌合病毒和完全型别转换病毒中的应用，以及这些病毒在克服现有疗法局限（如血清流行率、CAR受体依赖）方面的优势。同时，综述总结了基于非HAdV-C5的溶瘤腺病毒（OAds）在临床前研究和临床试验（如ONCOS-102、Enadenotucirev）中的疗效，强调了其在优化病毒递送、增强抗肿瘤免疫反应（如表达GM-CSF、CD40L、TNFα/IL-2）和扩大癌症治疗选择方面的巨大潜力。

　　

引言

癌症治疗手段多样，包括手术、放疗、化疗和激素治疗，但这些方法常伴随严重副作用。近年来，免疫疗法和细胞疗法等更特异、个体化的治疗策略取得进展，其中溶瘤病毒（OVs），特别是溶瘤腺病毒（OAds），因其能选择性感染并杀死癌细胞，成为一种极具吸引力的替代方案。OAds可作为癌症免疫疗法单独使用，或与常规治疗及免疫检查点抑制剂联用。

腺病毒（Ads）是无包膜病毒，具有二十面体衣壳，大小约70–90 nm。目前已知116种人腺病毒类型，分为A–G物种，其中D物种包含最多类型，而E、F、G物种各仅含一两种类型。Ads基因组为线性双链DNA，大小约26–48 kb，两侧为反向末端重复序列（ITRs），编码约30–40个开放阅读框（ORFs），负责病毒生命周期中的复制、转录和组装等功能。基因组可分为早期转录单元（E1–E4）和晚期转录单元（L1–L5）。衣壳主要由六邻体、五邻体和纤毛三种蛋白构成，纤毛从二十面体顶点伸出，五邻体基座位于每条纤毛基部。

多数临床试验基于人5型腺病毒（HAdV-C5）骨架构建OAds，例如安柯瑞（Oncorine, H101）含E1B-55k缺失和完整E3区缺失；ONYX-015在E1B区有827 bp缺失和点突变；以及E1A蛋白中缺失氨基酸120–127（Δ24）以靶向Rb调控异常的细胞。随着基因工程技术进步，OAds开发进一步推进，包括插入肿瘤特异性启动子或免疫刺激转基因以增强抗癌效果。然而，尽管存在116种人Ads和更多非人Ads，为基因工程和转化研究提供了巨大天然多样性，但基于非HAdV-C5的OVs研究仍十分有限。

非5型人腺病毒溶瘤病毒的基因工程与分子设计进展

非HAdV-C5的OAds研究有限的主要原因之一是缺乏快速高效的方法来克隆和遗传修饰这些病毒的基因组。获取完整Ad基因组作为病毒或载体的策略包括传统方法如分子克隆、基于粘粒的方法、在细菌和真核细胞中进行同源重组（HR）。近年来，更先进的方法被探索用于捕获完整Ad基因组并进行遗传修饰，例如模块化腺病毒基因组组装和细菌中的先进同源重组方法（HRB）。

模块化腺病毒基因组生成可基于传统克隆或先进克隆和组装方法（如Gibson组装、NEBuilder HiFi DNA组装克隆、In-Fusion克隆）以实现无疤痕组装。使用后者时，不同模块（含有带短同源臂（HAs）的Ad基因组部分）通过聚合酶链反应（PCR）扩增，随后组装。组装后，线性化完整Ad基因组转染至包装细胞系。

同源重组在细菌中（HRB）已成为大基因插入或修饰多种Ad类型的替代方法。先前的重组工程方法包括λ噬菌体的Red重组系统，使用galK阳性/阴性选择和大肠杆菌中的线性-环状同源重组。针对多样Ad类型的载体化和修饰，基于HRB的高通量策略被发明，该方法利用RecET重组酶系统。在此方法中，Ad基因组的载体化始于四个PCR产物，包含细菌骨架、5′ ITR、反选择标记盒（SM）和3′ ITR。这四个PCR产物两侧带有HAs，在大肠杆菌菌株GBRedGyrA462中通过L-阿拉伯糖诱导重组酶活性重组为一个质粒。SM包含氨苄青霉素抗性用于阳性选择和来自CcdA/CcdB毒素-抗毒素系统的CcdB用于反选择。在正常大肠杆菌中，CcdB毒素会结合DNA旋转酶复合物，阻止复制期间DNA的重新密封，从而导致细胞死亡。由于该特定大肠杆菌菌株中的突变，CcdB毒素无法靶向细菌内的DNA旋转酶A亚基（GyrA）。因此，在反选择期间，带有SM的质粒可以存活。随后，穿梭质粒通过限制性酶切线性化，Ad基因组通过线性-线性同源重组（LLHR）插入到大肠杆菌菌株GB05-dir中，该菌株也具有L-阿拉伯糖诱导重组酶活性。为简化此方法，待载体化Ad基因组的左右ITR作为HAs引入含有反选择标记的质粒的线性PCR产物中。与线性Ad基因组一起，LLHR在特殊大肠杆菌菌株GB05-dir中发生。自重组工程和RecET系统发现以来，至今已有40多种不同Ad类型被载体化。

基于嵌合溶瘤腺病毒的临床前与临床研究

多数基于HAdV-C5骨架的OAds具有常见的修饰位点，包括E1和E3转录单元、纤毛和六邻体编码区。在从HAdV-C5完全切换到另一种Ad类型之前，开发了具有HAdV-C5骨架的嵌合Ad载体，这些载体含有来自替代Ad类型的纤毛或六邻体区域（超变区HVRs）。这些嵌合OAds及其在临床前和临床研究中的探索已汇总于表中。

早在1996年，就产生了包含不同Ad类型嵌合体的OAds，主要是为了克服Ad5使用CAR作为其主要受体的障碍，而CAR在肿瘤细胞上常下调。例如，Ad5的纤毛被修饰以携带HAdV-B3的 knob 结构域；其他研究还探索了携带HAdV-B34、HAdV-B35、HAdV-D37或HAdV-D49 knob 的嵌合纤毛。第二种策略包括在Ad5的纤毛 knob 中插入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽，使病毒能够利用α_vβ₃或α_vβ₅整合素进入细胞。值得注意的是，应用RGD修饰的OAd的临床试验在胶质瘤患者中显示出 promising 的结果。最近，通过将六邻体的HVRs与罕见Ad类型HAdV-D43的HVRs交换，证明该病毒可逃避免抗HAdV-C5的中和抗体。另一项研究通过将随机肽展示插入HAdV-C5的纤毛 knob 中进行Ad定向进化，以选择改进的OAds。这些带有hTERT启动子的OAds在端粒酶表达的细胞系中复制受限，并在各种肿瘤细胞中显示出增强的裂解能力。另一项研究通过在HAdV-C5纤毛的HI环中插入程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的表位（70-77个氨基酸）来探索纤毛修饰。该OAd在程序性死亡配体1阳性的癌细胞中显示出病毒转导效率的显著提高。

纤毛修饰的病毒也在临床研究中得到探索。纤毛修饰病毒Ad5/3-?24-GM-CSF（ONCOS-102）、Ad5/3-E2F-Δ24-GMCSF（CGTG-602）和Ad5/3-E2F-?24-hTNFa-IRES-hIL2（TILT-123）代表了具有HAdV-C5骨架的嵌合OAds。ONCOS-102最初在一项剂量递增研究中进行分析，评估局部治疗后的安全性、有效性和免疫学终点。结果显示，该治疗导致T细胞浸润肿瘤和PD-L1上调。此外，ONCOS-102被探索用于治疗抗PD-1耐药的晚期黑色素瘤。因此，在这项临床试验中，ONCOS-102与派姆单抗（pembrolizumab）联合使用，后者是一种阻断PD-1受体的抗体，也促进了T细胞向肿瘤部位的浸润。在另一项临床研究中，ONCOS-102与培美曲塞和顺铂/卡铂联合用于治疗恶性胸膜间皮瘤患者。

嵌合OAd CGTG-602编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），在13名标准疗法难治的实体瘤患者中进行了研究。该研究表明，OAd治疗在分析患者活检时导致浸润性T细胞。另一个有趣的OAd是TILT-123，编码肿瘤坏死因子α（TNFα）和白介素-2（IL-2）。这种基于HAdV-C5并携带HAdV-B3纤毛的嵌合OAd在多项临床试验中进行了分析。一项最近应用TILT-123的研究包括治疗铂类耐药难治性卵巢癌患者，并与派姆单抗联合使用。此处评估了安全性，结果鼓舞人心，支持将该OAd与其他已建立的抗癌疗法（如检查点抑制剂抗癌药物）联合进行进一步探索。

基于非5型腺病毒的临床前试验与临床试验

理论上，所有应用于HAdV-C5的研究策略也可用于基于任何其他人Ad类型的OAds。因此，将用于HAdV-C5的遗传修饰直接转移到来自其他人Ad物种的替代Ads可能具有吸引力。基于替代Ad类型的OAds的潜在优势包括：（i）在人群中的血清流行率可能较低；（ii）OAd通过非CAR依赖机制进入肿瘤细胞；（iii）所探索的新型Ad类型的复制效率可能具有细胞类型特异性，并且在所探索的肿瘤细胞中更强劲。然而，完成Ad类型转换的OAds数量相当少。例如，来自A、E、F、G物种的Ads至今尚未作为OAds进行探索。因此，本综述重点关注B、C、D物种的OAds，这些研究的OAds在临床前和临床研究中的总结已提供于表中。

1985年，首次显示缺失E1A的HAdV-C2具有增强的溶瘤作用。三十多年后的2011年，首次描述了完全基于HAdV-B3的物种B衍生OAd。作为细胞进入的受体，HAdV-B3利用Desmoglein 2（DSG-2），并且OAd Ad3-hTERT-E1A使用hTERT启动子实现肿瘤特异性复制。2017年，引入了用于肿瘤细胞特异性复制的OAd Ad3-hTERT-CMV-hCD40L。该病毒编码人CD40L，一种在CD4⁺ T细胞上表达的跨膜II型蛋白，其受体主要表达于抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）。因此，该OAd可以激活DCs，从而可能增加肿瘤特异性T细胞反应。HAdV-B3在选择使用定向进化的OAds中也扮演了重要角色，这代表了一种生成新型OAds的创新方法，例如ColoAd1。该OAd是通过用几种野生型Ads共感染细胞并随后传代以允许重组事件而选择的。ColoAd1主要包含HAdV-B3序列，但在E2B区域，存在频繁被HAdV-B11序列替换的情况。此外，ColoAd1的特点是一个几乎完整缺失的E3区域和一个较小的第二缺失。相同的定向进化策略应用于另一项研究，但这里是为了选择卵巢癌细胞。选择使用来自B-F物种的Ads生成的库导致了OvAd1和OvAd2，它们包含ColAd1和HAdV-B3的序列。2021年，首次引入了完全基于HAdV-B35的OAd。这种不依赖CAR的OAd Ad35-hTERT-E1A在各种癌细胞系中显示出优于基于HAdV-C5的OAd的效果。另一种物种B OAd基于HAdV-B11（RCAd11pADP），通过表达Ad死亡蛋白（ADP）进行武装。该OAd在体外和体内显示出增强的转移性前列腺细胞裂解。

第一个非HAdV-C5肿瘤特异性物种C病毒于2022年开发。在这项研究中，Δ24缺失被引入HAdV-C1、2、6的E1区域，此外，这些病毒还武装了来自番茄丛矮病毒的RNA干扰抑制蛋白P19。这些OAds在体外显示出强大的肿瘤细胞裂解能力，并在体内增强了肿瘤细胞杀伤能力。另一种使用HAdV-C6作为骨架的OAd是Ad6-hT-GM-CSF，其中E1A基因在hTERT启动子的控制下表达，此外，该病毒还武装了GM-CSF，GM-CSF被插入到E3区域。该OAd在叙利亚 hamster 胆管癌模型中显示出强大的溶瘤和免疫刺激作用。

尽管D物种代表了最大的人Ads群体，但基于此物种的OAds十分稀少。2020年，生成了HAdV-D26、28、45、48，编码插入E3区域的钠碘同向转运蛋白（hNIS）。这些病毒在广泛的癌细胞系中进行了分析，导致强劲的复制。另一项研究调查了含有肽A20的HAdV-D10，该肽选择性结合αvβ6整合素。这两项研究中描述的D物种病毒显示出有前途的病毒疗法特征，结合了低血清流行率和强大的癌细胞裂解能力。然而，肿瘤特异性复制仍有待解决，例如通过插入肿瘤特异性启动子驱动E1区域的表达。请注意，至今尚未探索来自A、E、F和G物种的Ads作为OAds。然而，随着新型病毒基因组工程技术和遗传修饰基本上任何Ad类型的可能性，可以推测在不久的将来也会有来自这些物种的更多OAds可用。

许多临床试验使用完全基于HAdV-C5骨架的OAds进行。世界上第一个OAd安柯瑞（Oncorine, H101）于2005年在中国获批，基于HAdV-C5。安柯瑞在II期临床试验中进行了研究，并在多中心研究中显示出与化疗联合治疗头颈部鳞状细胞癌和鼻咽癌的潜力。然而，至今使用嵌合Ads或来自不同Ad物种的Ads的OAds的临床试验数量有限。第一个非HAdV-C5 OAd（Ad3-hTERT-E1A）用于I期临床试验。此处，OAd被静脉注射于患有非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌、肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、卵巢癌和甲状腺癌的患者。

Enadenotucirev（ColoAd1）自2017年以来在多项临床研究中得到探索。在一项I期临床试验中，通过静脉输注ColoAd1于可切除结肠癌患者、NSCLC患者、尿路上皮细胞癌和肾癌患者中研究了其作用机制。此处，17名患者在研究第一天接受单剂量ColoAd1瘤内治疗。切除后，额外给予一剂ColoAd1静脉注射。该研究提供了这种方法的可行性，包括ColoAd1的静脉输送。OAds NG-641和NG-350A基于ColoAd1，并分别武装了蛋白质导向的双特异性T细胞激活剂抗体（FAP-Tac）、CXCL9、CXCL10、IFNα或抗CD40抗体。NG-350A被注射到患有晚期上皮瘤的患者中，并提供了OAd递送至肿瘤和病毒复制的证据。

总之，OAds的开发是一个令人兴奋的领域，对于主要基于HAdV-C5和HAdV-B3骨架的已建立载体，已显示出对肿瘤患者的高潜力。然而，尽管HAdV-C5有其局限性，但使用非HAdV-C5 OAds也存在障碍，特别是在计划探索C物种以外的Ad类型时。物种C Ads，特别是HAdV-C2和HAdV-C5，在基础病毒学研究中得到了详细表征，包括它们的复制周期和病毒-宿主相互作用。对于转化研究，也主要探索了基于HAdV-C5的载体。因此，对于这些物种C型HAdVs，有深入的信息可用。然而，关于大多数其他来自其他物种的HAdV类型的基本知识， regarding 复制周期和病毒-宿主相互作用，通常十分匮乏。因此，生成、生产和放大来自其他HAdV物种的OAds可能具有挑战性。例如，当考虑临床试验时，建立生产细胞系以实现高滴度和纯净的载体制备可能很困难。此外，肿瘤细胞杀伤的有效性可能是一个限制因素，潜在的复制效率需要通过武装这些OAds with 细胞杀伤增强因子来增强。

利用至今已识别的所有116种人Ads的完整天然多样性的前景，将为进一步提高OAds的有效性开辟道路。我们相信，随着克隆技术和DNA合成技术的进步，可以实现基于任何Ad类型的新型OAds的生成。许多效应器转基因已经被并正在被测试，以增加OAds的溶瘤潜力，以及触发或增加针对 respective 肿瘤的抗肿瘤免疫反应。