综述：非感染性葡萄膜炎中的生物制剂：全面综述

《Delhi Journal of Ophthalmology》：Biologic Agents in Noninfectious Uveitis: A Comprehensive Review

　　尿DNA甲基化检测技术近年来在膀胱癌（BCa）诊断中取得显著进展，传统方法存在样本需求高、操作复杂等局限。本文综述了微流控、数字PCR和CRISPR等新兴技术在甲基化检测中的应用，指出其可提高诊断效率与准确性。已获FDA/NMPA认证的试剂盒如BE和URIFIND显示高灵敏度（87.8%-90%）和特异性（85.4%-93.3%），为BCa早期筛查和预后评估提供可靠工具。

　　近年来，尿液DNA甲基化在膀胱癌（BCa）检测中的应用取得了显著进展。DNA甲基化作为表观遗传学的一种重要修饰方式，通过在DNA序列的特定位置添加甲基基团，影响基因表达，而不改变DNA的碱基序列。这一特性使得DNA甲基化在癌症诊断、预后评估以及疾病监测方面展现出巨大潜力。研究表明，DNA甲基化水平的异常变化与肿瘤的发生和发展密切相关，尤其在早期肿瘤阶段即可检测到显著差异。因此，利用尿液中的DNA甲基化标志物进行膀胱癌筛查和诊断，成为非侵入性液体活检研究的重要方向。

尿液作为获取DNA甲基化信息的来源，具有无创、易获取和重复性好的优势。相较于传统的侵入性诊断方法，如膀胱镜检查（cystoscopy）或经尿道膀胱肿瘤切除术（TURBT），尿液检测不仅降低了患者的不适感和感染风险，还显著减少了医疗成本。然而，传统的DNA甲基化检测技术存在一定的局限性，例如对样本量要求较高、操作流程复杂、检测结果不够稳定等。这些因素限制了其在临床中的广泛应用。因此，研究人员不断探索新的检测技术，以提高尿液DNA甲基化检测的效率和准确性，使其更适用于大规模临床筛查。

在临床研究中，已经开发出多种基于DNA甲基化的生物标志物，并成功构建了多个诊断模型。这些模型在膀胱癌的早期检测、复发监测和预后评估方面表现出较高的敏感性和特异性。例如，Chen等人开发的utMeMA模型，基于两个甲基化标志物OTX1和SOX1-OT，其诊断准确率达到了86.7%，敏感性为90.0%，特异性为83.1%。此外，其他研究团队也通过不同的方法筛选出多个具有潜力的甲基化标志物，如ONECUT2/VIM、GHSR/MAL、TRNA-Cys/SIM2/NKX1–1、NID2/Twist1、CFTR/SALL3/TWIST1等。这些标志物在不同研究中展现出不同的诊断性能，为膀胱癌的非侵入性检测提供了多样化的选择。

目前，已有部分基于尿液DNA甲基化的检测产品获得了美国食品药品监督管理局（FDA）和中国国家药品监督管理局（NMPA）的批准。例如，Bladder EpiCheck（BE）测试是一种基于15个基因位点的DNA甲基化检测方法，已被批准用于检测膀胱癌的复发情况。该方法通过离心尿液样本、提取DNA，并利用甲基化敏感的限制性内切酶进行消化处理，最终通过实时荧光定量PCR（qPCR）进行分析。研究显示，BE测试在非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）患者的随访中表现出较高的负预测值（NPV），尤其是在排除低级别（LG）Ta肿瘤的复发方面，其NPV达到了99.3%。这表明，BE测试在临床实践中能够有效减少不必要的膀胱镜检查次数，提高患者的生活质量。

另一个获得FDA“突破性设备认定”的尿液DNA甲基化检测产品是URIFIND。该产品基于Chen等人开发的utMeMA模型，能够以较高的敏感性和特异性（分别为87.8%和85.4%）检测膀胱癌。其整体准确率达到了86.6%，并在临床验证中表现出较高的阳性预测值（PPV）为96.0%。这表明，URIFIND不仅能够有效识别膀胱癌，还能够为医生提供可靠的诊断工具，从而提升早期筛查的效率和准确性。

此外，TWIST1基因的甲基化检测也逐渐成为膀胱癌诊断的重要手段之一。Hermanns等人通过qPCR-MethyLight方法，对211名膀胱癌患者的尿液样本进行了分析，结果显示TWIST1的甲基化水平在膀胱癌患者中显著升高，其敏感性为82%至89%，特异性为94%至100%。然而，该方法在预测肿瘤分级方面的特异性较低，仅为61.1%。因此，尽管TWIST1甲基化检测具有一定的临床价值，但仍需进一步优化以提高其诊断性能。

在技术层面，尿液DNA甲基化检测的流程通常包括尿液样本的收集、DNA提取、甲基化分析以及数据解读。尿液样本的收集需注意采集时间、样本保存条件和处理方式，以确保DNA的质量和完整性。DNA提取是检测过程中的关键步骤，需要使用高效且稳定的提取方法，以减少样本损失和污染。对于甲基化分析，传统的甲基化特异性PCR（MSP）方法虽然能够检测特定甲基化位点，但其定量能力有限。而近年来，一些新兴技术的引入为甲基化检测带来了新的可能性。例如，微流控技术（microfluidics）能够将多个实验步骤集成到芯片上，实现高通量、自动化和高灵敏度的分析。这一技术不仅减少了实验耗时，还降低了样本消耗，提高了检测的稳定性。

数字滴定PCR（ddPCR）则是另一种具有广泛应用前景的技术。该技术通过将PCR反应分成多个独立的微滴，利用泊松统计原理实现对目标核酸的精确定量。与传统的实时qPCR相比，ddPCR无需依赖外部标准曲线，能够进行绝对定量，同时具备更高的灵敏度和抗干扰能力。这一特性使其在复杂样本类型（如尿液、血液、粪便等）的甲基化检测中表现出色。例如，Pharo等人利用ddPCR技术对膀胱癌细胞系进行了甲基化谱型分析，并构建了一个名为BladMetrix的检测面板。该面板在273名出现血尿的患者尿液样本中展现出92.1%的敏感性、93.3%的特异性和98.1%的负预测值，显著降低了膀胱镜检查的频率，为膀胱癌的非侵入性诊断提供了新的解决方案。

CRISPR技术作为一种革命性的基因编辑工具，也在DNA甲基化检测中展现出独特的潜力。该技术利用Cas蛋白和引导RNA的协同作用，能够精准识别和修饰特定DNA序列。在膀胱癌甲基化检测方面，Li等人开发了一种名为HOLMESv2的方法，结合了热稳定CRISPR-Cas12b系统与亚硫酸氢盐处理，实现了对目标DNA甲基化水平的高效、精准检测。该方法在不同细胞系中的检测结果与下一代测序（NGS）方法高度一致，表明其在甲基化研究中的可靠性。尽管目前CRISPR技术在尿液甲基化检测中的临床应用仍处于探索阶段，但其在灵敏度、特异性和操作简便性方面的优势，使其成为未来研究的重要方向。

尽管这些技术在膀胱癌的早期诊断和监测方面表现出良好的前景，但在实际临床应用中仍面临诸多挑战。例如，现有的检测方法成本较高，可能影响其在基层医疗机构的普及。此外，部分技术的标准化程度仍有待提高，以确保检测结果的一致性和可重复性。因此，未来的研究需要进一步优化这些技术，降低成本，提高效率，并推动其在更大范围内的应用。同时，结合生物信息学和基因组学的研究手段，有助于更全面地理解DNA甲基化在肿瘤发生和发展中的作用，从而为膀胱癌的精准诊断和个性化治疗提供更加可靠的依据。

综上所述，尿液DNA甲基化检测作为非侵入性液体活检的重要组成部分，正在成为膀胱癌诊断和监测的新兴工具。随着技术的不断进步，尤其是微流控、ddPCR和CRISPR等新兴技术的应用，尿液DNA甲基化检测的准确性、效率和适用性将进一步提升。这些技术不仅能够为医生提供更加便捷的诊断手段，还能帮助患者减少侵入性检查的频率，提高治疗的及时性和有效性。未来，随着更多甲基化标志物的发现和检测技术的完善，尿液DNA甲基化检测有望成为膀胱癌筛查和诊断的主流方法之一，为临床实践带来革命性的变化。