定制化胶原结合的白蛋白融合超活性凝血因子IX调控体内分布与功能特性

　　本研究针对血友病B替代疗法中凝血因子IX(FIX)血浆半衰期短及血管外分布影响疗效的问题，通过工程化改造FIX Padua变体与优化FcRn结合的人血清 albumin(HSAQMP)融合蛋白，系统探究了K5A/K5R突变对胶原结合能力、药代动力学特性及止血功能的影响。结果表明：K5R突变显著延长功能性半衰期至80小时并增强血管外分布，而K5A突变可实现早期血浆浓度峰值但清除迅速。该研究为血友病B的个体化治疗提供了新型长短效治疗方案选择。

　　

血友病B作为一种X染色体连锁的出血性疾病，长期以来依赖外源性凝血因子IX（Coagulation Factor IX, FIX）的替代治疗。然而，天然FIX在人体内的半衰期仅18-22小时，患者需要频繁注射以维持有效止血浓度，这给患者生活带来极大负担。虽然通过聚乙二醇化、Fc融合或白蛋白融合等技术已成功将半衰期延长至3-4天，但治疗效果仍受限于个体间差异、血管外FIX沉积以及患者CRM（Cross-Reactive Material）状态的影响。尤其值得注意的是，有证据表明FIX可通过其Gla结构域与血管外IV型胶原（Col4）结合形成“储备库”，这对维持长期止血功能具有重要作用，但工程化改造FIX-Col4相互作用如何影响药代动力学与疗效，至今尚未得到系统研究。

为此，Kristin Hovden Aaen、Maria Francesca Testa等联合团队在《Nature Communications》发表了最新研究成果，通过合理设计FIX Padua（R338L超活性突变）与工程化人血清 albumin（HSA_QMP）的融合蛋白，并引入调控Col4结合的K5A/K5R点突变，深入探究了这些变异对蛋白功能、细胞回收机制、体内分布及止血效果的影响。该研究不仅验证了HSA_QMP在延长半衰期方面的优势，还首次揭示K5R突变可显著增强FIX在血管外组织的滞留并延长功能性半衰期，而K5A突变则更适合短期快速提升血浆FIX水平，为血友病B的“个体化长效治疗”提供了重要理论依据和实践策略。

在研究过程中，团队运用多种关键技术方法：采用人细胞表达系统制备纯化所有FIX-HSA融合蛋白变体；通过SPR（表面等离子共振）和ELISA（酶联免疫吸附测定）分析FcRn结合特性；利用HERA（人内皮细胞回收试验）评估细胞内存与再循环；在三种小鼠模型（hFcRn转基因Tg32、FIXplus Balb/c及FIX-KO血友病B模型）中进行药代动力学、组织分布与尾部切割出血分析；并借助免疫组化与免疫荧光观察蛋白在组织中的分布情况。

FIX-HSA融合蛋白的设计与活性表征

研究人员构建了四种不同的FIX-HSA融合蛋白（结构如图1所示），分别在FIX的Gla结构域第5位进行K5A或K5R突变，并与野生型HSA（HSA_WT）或三重突变HSA_QMP（E505Q/T527M/K573P）融合。所有变体均在人细胞中成功表达并纯化至单体形式。通过aPTT（活化部分凝血活酶时间）法和发色底物法检测凝固活性，发现K5R对活性无显著影响，而K5A则使活性降至野生型的50%。不过当与Padua（R338L）突变组合时，所有变体均表现出超活性特征（平均提高9.5倍）。此外，在磷脂结合实验中，K5R变体显示最强结合能力，而K5A结合最弱，说明K5位点对磷脂膜相互作用具有调控作用。

WT（b）和Padua-HSA_QMP（c）的凝固活性。d 各变体的比活性（以FIX-HSA_WT=1计）。统计显著性经双尾t检验（n=4；p=0.0010, **p<0.0001）。'>

FcRn结合与细胞回收不受K5工程化影响

通过ELISA与SPR分析，团队证实所有HSA_QMP变体在pH 5.5下与hFcRn和mFcRn均呈现强结合，且在pH 7.4下无结合，符合FcRn-pH依赖性结合特征。更重要的是，K5A或K5R突变并未改变其与FcRn的亲和力（见表1）。HERA试验进一步显示，HSA_QMP变体的细胞内化和再循环效率显著高于HSA_WT变体，而K5突变对此过程无影响。这些结果说明，HSA_QMP的工程化是延长半衰期的关键，且K5突变不影响FcRn介导的细胞回收通路。

K5工程化在具有内源性FIX的小鼠中不影响血浆半衰期

在hFcRn转基因小鼠（Tg32，模拟CRM+患者）中，注射后24小时，HSA_QMP变体的血浆浓度显著高于HSA_WT变体（14.4 μg/mL vs 4.0 μg/mL）。所有变体的血浆半衰期均接近（约20-28小时），且K5突变未引起显著差异。这一结果表明，在存在内源性FIX竞争Col4结合的情况下，QMP工程化是主导半衰期延长的因素。

在野生型小鼠中QMP延长FIX-HSA半衰期

在FIXplus Balb/c小鼠（表达鼠FIX）中，HSA_QMP变体显示出血浆半衰期延长（约30-39小时），而K5A变体（Padua_KA-HSA_QMP）的半衰期略短于其他QMP变体。这说明QMP工程化在mFcRn表达背景下仍能有效延长半衰期，但K5A可能因Col4结合能力减弱而加速清除。

K5工程化在血友病B小鼠中调控PK特性与血管外分布

在FIX-KO小鼠（模拟CRM-患者）中，K5A变体（Padua_KA-HSA_QMP）在注射后1小时血浆浓度最高（24.2 μg/mL），但清除速率最快（半衰期17.7小时）。相反，K5R变体（Padua_KR-HSA_QMP）在96小时时仍维持较高血浆浓度，半衰期达26小时，且功能性半衰期延长至80.3小时（Padua-HSA_QMP为30.6小时）。组织分布分析显示，K5R变体在肝脏、肾脏、肺和膝关节中的浓度显著高于K5A变体（最高达5倍），免疫荧光与免疫组化结果进一步证实了这一趋势。

K5R赋予持续的功能活性提升

在血友病B小鼠中，K5A变体在早期（1小时）显示最高活性（1232.6%），但96小时后活性迅速下降至48.2%。而K5R变体在整个观察期内维持较高活性，96小时时仍为20.7%的参照活性，并表现出最长的功能性半衰期（80.3小时）。尾部切割实验证实，Padua_KR-HSA_QMP的活性与出血量呈负相关，证明其具有良好的止血效果。

本研究通过多模型、多层次的实验分析，证实了以下核心结论：首先，HSA_QMP工程化可显著延长FIX半衰期，且不受种属限制；其次，K5R突变通过增强Col4结合能力，显著提升蛋白在血管外组织的分布并延长功能性半衰期，适用于长期预防治疗；而K5A突变则适用于短期快速提升血浆FIX水平，如按需治疗。该研究不仅深化了对FIX-Col4相互作用在药代动力学中作用的理解，还为血友病B的个体化治疗提供了新策略。尤其值得注意的是，根据患者CRM状态（是否表达功能障碍FIX），可选择具有不同Col4结合特性的产品，从而实现真正意义上的“精准治疗”。未来，这种基于生物分布调控的治疗策略也有望推广至其他蛋白类药物中。