帕唑帕尼靶向JNK1/2与P38 MAPK通路减轻博来霉素诱导肺纤维化的机制研究

　　本刊推荐：本研究首次揭示多靶点酪氨酸激酶抑制剂帕唑帕尼（Pazopanib）通过抑制MEKK2/3-mRNA表达，下调磷酸化JNK1/2（p-JNK1/2）和P38（p-P38）蛋白活性，显著改善博来霉素（Bleomycin）诱导的小鼠肺纤维化模型。该药物有效调控炎症因子（IL-1β、IL-13、IL-33、TNF-α、NF-κB P65）和纤维化标志物（TGF-β1、α-SMA）表达，为特发性肺纤维化（IPF）治疗提供新策略。

　　

1 引言

特发性肺纤维化（IPF）作为最常见的间质性肺病，全球年发病率达3-9/10万，中位生存期仅2-4年。其病理机制涉及肺泡上皮微损伤引发的异常修复过程，导致促纤维化介质（如IL-1β、IL-6、TNF-α）释放和肌成纤维细胞活化。这些α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性细胞是胶原过度沉积和细胞外基质（ECM）积累的主要效应细胞。现有抗纤维化药物（尼达尼布和吡非尼酮）无法实现完全治愈，肺移植仍是唯一根治手段，亟需开发新型治疗策略。

博来霉素诱导肺纤维化模型的核心机制涉及IL-33在肺巨噬细胞和气道上皮中的过表达。该因子通过诱导M2型巨噬细胞极化，增强IL-13、IL-6、TNF-α和转化生长因子β（TGF-β）表达。TGF-β超家族信号通路（特别是TGF-β1）在纤维化进程中起核心作用，通过Smad依赖和非依赖途径（包括JNK、P38、ERK等MAPK通路）促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。

MAPK家族作为Ser/Thr激酶，通过三级激酶级联（MEKK-MEK-MAPK）转导细胞外信号。MEKK2和MEKK3是激活JNK和P38通路的关键上游激酶，同时参与NF-κB活化过程。既往研究表明JNK基因敲除小鼠对博来霉素诱导的肺纤维化具有抵抗性，提示靶向MAPK通路可能是潜在治疗策略。

帕唑帕尼作为多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，可抑制MEKK2/3表达。最新研究证实其在急性肺损伤模型中具有保护作用，本研究旨在探索其通过MEKK2/3-JNK/P38轴缓解肺纤维化的潜力。

2 结果

2.1 帕唑帕尼对体重和肺指数的影响

博来霉素组小鼠体重显著下降（p<0.001），肺指数（肺重/体重比）显著升高（p<0.001），提示系统毒性和肺水肿。帕唑帕尼联合治疗显著改善体重减轻（p<0.01）和肺指数升高（p<0.05），但未完全恢复至对照组水平。实验期间无动物死亡。

2.2 肺组织病理学改变

对照组和帕唑帕尼单药组肺组织结构正常，肺泡间隔薄，血管结构完整，支气管周围仅见少量单核炎性细胞浸润。博来霉素组呈现间质性肺炎特征：肺泡间隔中度增厚、血管严重扩张充血、支气管周围炎性细胞浸润显著增加、成纤维细胞活性和胶原纤维密度明显升高。联合治疗组显示近乎完整的肺泡间隔、轻度炎性细胞浸润、最小程度的胶原纤维密度和成纤维细胞活性。

2.3 胶原沉积与纤维化重塑评估

Masson三色染色显示对照组和帕唑帕尼单药组仅见 minimal 胶原沉积。博来霉素组胶原面积百分比显著增加（p<0.001），而联合治疗使胶原沉积显著减少（p<0.001），恢复至对照组水平。

2.4 α-SMA和TGF-β1免疫组化表达

对照组和帕唑帕尼单药组TGF-β1和α-SMA免疫反应性较低。博来霉素组两种标志物表达显著增加，联合治疗组表达显著降低（p<0.001），接近基线水平，表明帕唑帕尼有效抑制肌成纤维细胞活化。

2.5 MEKK2/3-mRNA与p-JNK/p-P38蛋白表达

博来霉素显著上调MEKK2、MEKK3的mRNA表达以及p-JNK1/2、p-P38蛋白表达（p<0.001）。帕唑帕尼联合治疗显著降低这些指标（p<0.001），但仍高于对照组水平，提示其通过部分抑制MEKK2/3-MAPK信号级联发挥作用。

2.6 细胞因子水平调控

博来霉素显著提升TNF-α、IL-1β、IL-13、IL-33和NF-κB P65水平（p<0.001）。帕唑帕尼联合治疗使所有炎症信号显著降低（p<0.001），恢复至接近基线，证实其抗炎作用与抗纤维化效果密切相关。

3 讨论

本研究首次证实帕唑帕尼在博来霉素诱导的肺纤维化模型中具有保护作用，其机制涉及：改善体重减轻和肺组织病理学特征；抑制MEKK2和MEKK3 mRNA表达；降低p-JNK1/2和p-P38蛋白表达；调节IL-1β、IL-13、IL-33、TNF-α和NF-κB P65水平；逆转TGF-β1和α-SMA升高。

体重减轻和肺指数升高是博来霉素早期炎症反应的典型表现，帕唑帕尼的改善作用表明其可缓解系统毒性。α-SMA作为肌成纤维细胞活化的标志物，其表达降低证实帕唑帕尼可抑制纤维化核心细胞进程。TGF-β1作为关键促纤维化细胞因子，通过Smad和非Smad途径促进ECM成分过度产生，帕唑帕尼对其表达的抑制与既往肝纤维化研究结果一致。

MAPK通路在纤维化发病中的作用已得到广泛认可。本研究证实帕唑帕尼通过抑制上游激酶MEKK2/3，下调JNK和P38磷酸化水平。JNK通路通过Smad4非依赖机制促进纤连蛋白合成，P38通路则通过TGF-β激活促进I型胶原产生。帕唑帕尼对MEKK2/3的抑制可能与其抑制NADPH氧化酶2亚基p47^phox磷酸化有关，从而减少髓系细胞活性氧生成。

炎症因子网络调控是帕唑帕尼作用的另一重要层面。IL-1β通过IL-17或直接激活TGF-β和c-Jun促进纤维化；IL-13与IL-1β协同激活血小板衍生生长因子（PDGF）；IL-33通过ST2依赖和非依赖方式参与IPF发展；TNF-α通过促进PDGF和TGF-β分泌以及调节lumican和整合素表达维持成纤维细胞持续活化。帕唑帕尼对这些细胞因子的全面调控显示其多靶点作用特征。

值得注意的是，帕唑帕尼作为多靶点酪氨酸激酶抑制剂，可抑制c-Kit、PDGFR-α/β、VEGFR-1/2/3等受体。最新研究提示其还可能通过抑制混合谱系激酶样蛋白（MLKL）磷酸化抑制坏死性凋亡，但这需进一步研究验证。

4 结论

帕唑帕尼通过抑制MEKK2/3表达，下调JNK和P38 MAPK信号通路，有效缓解博来霉素诱导的肺纤维化。其作用体现在组织病理学改善、胶原沉积减少、TGF-β1和α-SMA表达降低以及炎症细胞因子水平恢复正常。尽管结果表明其具有临床转化潜力，但需进一步评估安全性和毒性特征。

5 实验方法

5.1 动物与分组

24只雄性瑞士白化小鼠（25-30g）随机分为4组（n=6）：对照组（生理盐水腹腔注射）、帕唑帕尼组（10mg/kg/天，第15-28天）、博来霉素组（40U/kg，第0、3、7、10、14天）、联合治疗组（博来霉素+帕唑帕尼）。实验结束取肺组织进行后续分析。

5.2 组织学与生化分析

肺组织进行H&E和Masson三色染色，评估炎症和胶原沉积。免疫组化检测TGF-β1和α-SMA表达。Western blot检测p-JNK1/2和p-P38蛋白表达。qRT-PCR分析MEKK2和MEKK3 mRNA水平。ELISA检测IL-1β、IL-13、IL-33、TNF-α和NF-κB P65含量。

5.3 统计分析

数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验，p<0.05为显著差异。