黑色素瘤远处转移的瘤内蛋白基因组异质性研究揭示治疗新靶点与预后标志物

　　本综述通过整合蛋白质组学（MS）与转录组（RNA-Seq）数据，系统分析了24例黑色素瘤患者83处转移灶的分子特征，揭示了瘤内异质性主要源于细胞周期（Cell Cycle）、线粒体代谢（OXPHOS）、细胞外基质（ECM）和免疫通路（Immune Response）的蛋白表达差异，而非转移部位驱动。研究发现肝转移具有独特的代谢重编程特征，且脾转移与患者总生存期（OS）缩短显著相关（HR=3.91, p=0.009）。研究为免疫治疗时代前的黑色素瘤转移提供了基线分子图谱，为靶向治疗组合策略开发奠定基础。

　　

1 引言

黑色素瘤作为最具侵袭性的皮肤癌类型，全球年新增病例超过33万，死亡约6万例。其高突变率和异质性导致治疗耐药频发，尽管靶向BRAF/MEK和免疫检查点抑制剂（如抗PD-1/CTLA-4）已改善患者生存，但多数患者仍出现复发。瘤内异质性（ITH）及肿瘤微环境（TME）多样性是治疗失败的核心因素。本研究通过半快速尸检获取24例患者83处转移灶（以免疫治疗前样本为主），结合组织病理学、RNA测序和质谱蛋白质组学，深入探索黑色素瘤转移的蛋白基因组异质性。

2 材料与方法

2.1 样本收集与处理

样本采集符合赫尔辛基宣言，经伦理委员会批准（SE TUKEB 114/2012）。83个转移灶来自19个器官，尸检间隔时间（PMI）为24-96小时。组织切片经H&E染色和数字病理评估，标注肿瘤细胞比例、坏死区域和淋巴细胞浸润程度。

2.2 蛋白质组与转录组分析

蛋白质提取采用尿素裂解缓冲液，经超声处理、BCA定量后，使用AssayMAP Bravo平台进行酶解（Lys-C和胰蛋白酶）。肽段经高pH反相液相色谱（hpH-RP-HPLC）分馏，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在Q Exactive HF-X仪上进行数据非依赖采集（DIA）。RNA测序使用Illumina NextSeq 550平台，75bp单端读长。数据预处理包括Trimmomatic修剪、FastQC质控和STAR比对。

2.3 蛋白基因组整合分析

通过GATK和Mutect2调用RNA-Seq中的变异，经VEP注释后预测非参考肽段（NRPs）。使用定制流程将NRPs与质谱数据匹配，并通过PepQuery验证肽段-谱图匹配（PSMs）。构建队列特异的蛋白质序列数据库，包含UniProt参考序列和预测变异序列。

2.4 统计学与生物信息学

蛋白质组数据经log₂转换、中值标准化和缺失值插补（imputeLCMD包）。差异分析采用limma，通路富集使用GSEA。生存分析采用Cox回归和Kaplan-Meier曲线，聚类分析基于一致性聚类算法。

3 结果

3.1 队列临床特征

患者中位年龄51.5岁，男性占比70.8%。初诊分期以II期和III期为主。5年总生存率（OS）为33.3%，中位生存时间49个月。脾转移患者OS显著缩短（HR=6.08, p=0.01）。组织学显示转移灶以上皮样或小细胞形态为主，无纺锤形细胞。驱动基因（BRAF/NRAS/CKIT）突变在患者内部高度一致。

3.2 多组学数据质量

蛋白质组定量10,121个蛋白组，RNA-Seq检测61,541个转录本。肿瘤比例与RNA代谢、剪接、翻译和MYC靶标通路呈正相关（p<0.05）。转录组与蛋白质组相关性低（平均Spearman rho=0.128），仅131个基因显示强相关性（如MLANA、PMEL、S100家族），富集于上皮-间质转化（EMT）、缺氧和金属离子响应通路。

3.3 蛋白基因组变异

共鉴定1,177个独特蛋白序列变异（NRPs），对应627个框内/移码插入缺失、545个剪接变异和5个复杂变异。69%的NRPs仅存在于1-2例患者。69个蛋白携带 novel mutations（gnomAD频率≤1%），富集于黏着斑、免疫系统、囊泡运输和MAPK信号通路（如MPRIP、SND1、MAP2K1）。16个基因（如A2M、SPANXA2、HLA-C）的突变频率显著高于预期。

3.4 转移部位异质性

肝转移显示183个特异性上调蛋白（如代谢通路富集），脑转移富集GPX1变异。但转移部位的整体分子差异不显著，且与HPA组织特异性蛋白重叠较少，证实样本肿瘤纯度较高（平均肿瘤比例≥60%）。GSEA显示肝转移显著上调氨基酸/脂质代谢和过氧化物酶体通路，下调RNA剪接和氧化应激通路。

3.5 瘤内异质性聚类分析

蛋白质组聚类识别4个亚型：

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  C1：细胞周期、RNA剪接通路上调，富集CDK4、PARP1等靶点；
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  C2：免疫系统（中性粒细胞脱颗粒、补体通路）和细胞黏附通路上调；
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  C3：线粒体过程（OXPHOS）和代谢通路上调；
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  C4：细胞外基质（ECM）和上皮-间质转化（EMT）通路上调。
  约2/3患者转移灶跨多个簇，显示显著瘤内异质性。簇间TIDE评分差异预示免疫治疗响应异质性。

3.6 预后与验证

C1/C3主导患者OS较短（p=0.044），与TCGA数据一致（RNA剪接和线粒体通路富集者预后差）。外部队列（Van Allen、Gide等）验证部分通路预后价值，但免疫治疗背景下关联性存在差异（如线粒体通路在抗PD-1治疗中可能有益）。

4 讨论

本研究揭示黑色素瘤转移的异质性主要源于蛋白表达模式而非解剖位置。脾转移和C1/C3表型（细胞周期/代谢亢进）提示预后不良。NRPs和突变谱为靶向治疗提供新线索（如PARP1、CDK4、免疫相关基因变异）。研究局限性包括样本量小、PMI影响RNA质量及缺乏正常组织对照。未来需扩大队列并结合功能验证。

5 结论

本研究通过多组学整合描绘了免疫治疗前黑色素瘤转移的分子图谱，为开发针对异质性靶点的组合疗法奠定基础。数据强调多部位采样对精准治疗的重要性，并提供潜在靶点资源用于克服治疗耐药。