整合网络药理学与代谢组学揭示当归六黄汤治疗甲状腺功能亢进性肾病的作用机制及多靶点调控网络

　　本研究通过整合网络药理学、代谢组学及体内实验，系统阐明了当归六黄汤（DLD）治疗甲状腺功能亢进性肾病（HKD）的多成分-多靶点-多通路机制。研究证实DLD通过调控PI3K/AKT、MAPK信号通路及Nrf2/HO-1抗氧化系统，逆转甲状腺激素紊乱和氧化应激损伤，并发现亚油酸代谢、花生四烯酸代谢通路中5-HETE等关键生物标志物，为中药复方治疗内分泌代谢性疾病提供了科学依据。

　　

1. 引言

甲状腺功能亢进（Hyperthyroidism）以甲状腺激素过度分泌为特征，伴随神经兴奋、多汗、心悸、食欲亢进及体重下降等症状，并可导致肾脏损伤等并发症。当前临床主要采用抗甲状腺药物或甲状腺切除术治疗，但约13%患者出现过敏或毒性反应。中医药在内分泌疾病治疗中具有整体调节和副作用少的优势。当归六黄汤（Danggui Liuhuang Decoction, DLD）源自金代《兰室秘藏》，由当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄连、黄柏和黄芪组成，被列入首批《古代经典名方目录》，传统用于治疗阴虚火旺所致的盗汗，现代临床广泛应用于甲状腺功能亢进、多汗症及糖尿病并发症。

2. 材料与方法

2.1. 药物与试剂

DLD由等量当归、生地、熟地、黄芩、黄连、黄柏及双倍黄芪组成，经水煎、浓缩、冻干制粉。12种成分（包括小檗碱等）采用高效液相色谱（HPLC）定量。

2.2. 网络药理学分析

通过TCMSP数据库筛选DLD的91个活性成分（口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18），鉴定328个靶点基因。从OMIM、DrugBank等数据库获取HKD相关基因，Venn分析得到110个交集靶点。STRING数据库构建蛋白互作（PPI）网络，DAVID数据库进行GO功能与KEGG通路富集分析。

2.3. 动物实验

36只Wistar大鼠（雄性，SPF级）通过每日灌胃75 mg/kg甲状腺素和0.5 mg/kg利血平连续10天建立HKD模型，分为空白对照组（BC）、模型组（Mod）、阳性药组（PC，甲巯咪唑）及DLD低、中、高剂量组（3.12, 6.24, 12.48 g·kg^?1·d^?1）。检测指标包括体重、粪便含水量、血清甲状腺激素（T3、T4、TSH）、环核苷酸（cAMP、cGMP）、肾组织氧化应激指标（SOD、CAT、MDA）、Western blot（WB）分析PI3K/AKT通路蛋白（p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT）及抗氧化蛋白（Nrf2、HO-1）。

2.4. 代谢组学分析

血清样本经甲醇沉淀处理后，采用UHPLC-MS/MS进行代谢物检测，正负离子模式（ESI±）扫描。Progenesis QI软件进行峰对齐、归一化，MetaboAnalyst 6.0进行多元统计（PCA、OPLS-DA）及通路富集分析。

3. 结果

3.1. DLD多成分含量测定

HPLC成功定量DLD中12种成分，包括黄柏碱、木兰花碱、阿魏酸、黄连碱、表小檗碱、药根碱、巴马汀、黄芩苷、槲皮素等，10批次样品含量稳定。

3.2. 网络药理学揭示关键靶点与通路

110个交集靶点涉及TNF、AKT1等核心基因，KEGG富集显示PI3K/AKT、MAPK信号通路为最显著通路（p < 0.05）。构建“成分-靶点-通路”网络，证实DLD通过多靶点调控氧化应激、细胞增殖、免疫炎症等过程。

3.3. 动物实验验证

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  一般状态：HKD大鼠出现消瘦、竖毛、弓背、攻击行为及粪便干硬，DLD治疗后上述症状显著改善，高剂量组体重恢复接近阳性对照组。
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  激素水平：模型组T3、T4、cAMP/cGMP比值显著升高（p < 0.01），TSH降低，DLD剂量依赖性逆转该趋势。
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  氧化应激：模型组肾组织SOD、CAT活性下降，MDA升高，DLD干预后抗氧化酶活性恢复，脂质过氧化减轻。
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  蛋白表达：WB显示模型组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值上调，Nrf2、HO-1表达抑制；DLD治疗后PI3K/AKT磷酸化被抑制，Nrf2/HO-1通路激活。

3.4. 代谢组学分析

PCA与OPLS-DA显示BC组与Mod组代谢谱显著分离，DLD干预后（高剂量组）代谢轮廓向BC组回调。筛选出49个差异代谢物，VIP > 1.0且p < 0.05，主要富集于亚油酸代谢和花生四烯酸代谢通路。潜在生物标志物包括亚油酸、花生四烯酸及5-HETE。

3.5. 整合分析

代谢组学与网络药理学联合分析构建“代谢物-基因”网络，发现9个关键靶点（PLA2G1B、AKT1等）和7个核心代谢物（5-HETE、尿酸等）。KEGG富集再次证实PI3K-AKT信号通路为核心调控通路。

4. 讨论

本研究首次整合多学科技术揭示DLD治疗HKD的机制：

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  多成分协同：DLD中黄柏碱、黄芩苷等成分通过调控AKT1、TNF等靶点，抑制PI3K/AKT磷酸化，激活Nrf2/HO-1抗氧化通路，减轻甲状腺激素紊乱所致的氧化损伤。
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  代谢重编程：HKD模型呈现多不饱和脂肪酸（如亚油酸、花生四烯酸）代谢紊乱，5-HETE作为5-LOX代谢产物及Nrf2激活剂，其耗竭导致氧化应激加剧，DLD干预后代谢通路恢复正常。
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  临床意义：为DLD治疗内分泌性肾病提供药效物质基础及机制依据，并为中药复方研究提供“网络药理学-代谢组学-实验验证”整合策略。

局限性与展望

本研究未涵盖DLD体内成分代谢分析，缺乏体外细胞实验深挖机制，未来需建立DLD质量标志物（Q-marker）及开展靶点验证实验。