基于毛细管电泳与泰勒分散分析的脂质纳米粒（LNPs）物理化学特性表征新策略

　　本综述系统介绍了利用毛细管区带电泳（CZE）、压力驱动泰勒分散分析（TD）及其耦合模式（eTD）对载核酸（NA）脂质纳米粒（LNP）进行多维物化表征的创新策略。该方法在保持LNP结构完整性的前提下，可同步评估粒径、ζ电位、核酸分布及载药状态等关键质量属性（CQA），为基因治疗与mRNA疫苗的LNP制剂开发提供了高分辨率分析方案。

　　

引言：LNP表征的技术挑战与创新需求

脂质纳米粒（LNP）作为核酸（NA）递送载体，在基因治疗和mRNA疫苗领域展现巨大潜力，但其复杂结构对物化表征提出严峻挑战。现有分析方法如动态光散射（DLS）和冷冻透射电镜（cryo-TEM）虽能提供粒径与形态信息，却难以全面揭示核酸分布、载药状态及表面电荷特性。本研究提出一种基于毛细管电泳技术的多维分析策略，通过耦合电泳迁移与流体动力学行为，实现对LNP系统的原位、高分辨率表征。

材料与方法：创新分析平台构建

研究采用SCIEX PA800 Plus毛细管电泳系统，配备488 nm激光诱导荧光（LIF）检测器，以SybrGreen为核酸特异性荧光染料。通过优化背景电解质（BGE）成分为25 mM Tris（pH 8.0），在50 μm内径熔融石英毛细管中建立三种分析模式：毛细管区带电泳（CZE）、泰勒分散（TD）和电泳-泰勒分散耦合（eTD）。实验涵盖载DNA-LNP的制备（微流控混合技术）、透析纯化及荧光标记流程，系统比较了ALC-0315、SM-102和MC3三种离子化脂质构建的LNP特性。

理论框架：分离机制的物理化学基础

CZE模式依据电荷-流体动力学半径比（q/r_h）实现带电粒子分离，可推算ζ电位；TD模式基于层流抛物线流速分布与分子扩散的平衡，反映粒径分布特征；eTD创新性耦合电场与压力场，通过调节电压/压力比（15-25 kV/psi）实现粒子横向聚焦，显著提升分离分辨率。理论计算表明，LNP的有效电泳迁移率（μ_e）介于-3.7×10^-8至-4.1×10^-8 m²/V·s，对应ζ电位为-47.43至-52.15 mV。

结果与讨论：多维表征揭示LNP异质性

3.1 游离DNA与LNP的迁移行为差异

CZE(np)模式下，游离DNA呈现单一尖锐峰，而DNA-LNP显示宽谱信号，提示粒子群电荷异质性。eTD(np)进一步揭示LNP中存在多个亚群：主要群体迁移时间与游离DNA重叠，次要群体显示更高负电泳迁移率，可能对应表面核酸暴露程度不同的粒子变体。

3.2 脂质组成影响表征信号

三种LNP系统（ALC-0315/SM-102/MC3）在TD模式中显示相似峰宽（提示粒径接近），但信号强度与负峰特征显著不同，反映脂质组成影响染料渗透性与核酸可及性。eTD(np)谱图呈现特异性"指纹特征"，MC3-LNP在延迟迁移区出现增强信号，暗示其表面电荷分布特性差异。

3.3 未封装核酸的灵敏检测

eTD(rp)模式通过抑制电渗流（EOF），成功实现未封装DNA的分离检测（迁移时间2-3 min）。实验证实该信号对应游离DNA或核酸-脂质复合物，而非完整LNP结构。值得注意的是，单链RNA（ssRNA）与双链DNA（dsDNA）在CZE中呈现明显迁移差异，后者因更高电荷密度显示更快迁移行为。

3.4 稳定性监测与降解评估

加速老化实验（4℃储存4周）显示，所有LNP系统的eTD(np)谱图均出现延迟迁移变异体信号增强，同时DLS检测到流体动力学半径增大，提示粒子发生结构重组。丙醇处理实验证实完整LNP与解体LNP的信号强度差异达数倍，证明该方法可定量评估核酸封装效率。

3.5 方法学比较与优势

与传统DLS相比，TD分析避免了大粒子信号放大效应，更准确反映粒径分布；相较于SybrGold染料 exclusion assay，毛细管方法避免去垢剂干扰，提供更可靠的封装率数据；eTD耦合模式首次实现带电状态与流体动力学特性的同步解析，为理解LNP复杂结构提供新维度。

关键质量属性（CQA）分析的应用潜力

研究证实eTD指纹图谱可灵敏反映生产工艺参数（如混合速度、脂质比例）变化，适用于批次一致性监控。通过建立谱图特征与生物效能的关联，该方法有望成为LNP制剂关键质量属性控制的标准化工具。

技术局限与未来方向

当前技术仍需优化检测灵敏度与通量，未来需开发专用数据处理算法解析复杂谱图。拓展应用至病毒载体、蛋白复合物等生物纳米粒子表征，以及探索紫外/荧光双模式检测策略，将进一步提升方法普适性。

结论：多维表征新范式的建立

本研究构建的毛细管电泳多维分析平台，突破传统单参数检测局限，实现LNP粒径、电荷、核酸分布与稳定性的同步评估。eTD耦合模式尤为突出，其独特分离机制为纳米药物载体的结构解析提供新视角，为基因治疗产品的质量控制标准制定提供关键技术支撑。