开发绿色毛细管电泳法测定口服降糖药达格列净（Dapagliflozin）及其质量控制研究

　　本刊推荐：本研究首次建立了一种绿色毛细管电泳（CE）方法，用于测定口服降糖药达格列净（DAPA）。方法验证显示线性范围50–175 μg·mL?1（R2 > 0.999），检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为6.2和18.8 μg·mL?1，准确度达101.22%–104.63%。与传统高效液相色谱（HPLC）相比，CE法有机溶剂使用量极少、废物产生量低，经分析绿色度指标（AGREE）评估确认其环保优势，为药物质量控制提供了可持续分析方案。

　　

引言

糖尿病是一种全球性健康问题，影响数百万人，其中2型糖尿病最为普遍。达格列净（Dapagliflozin, DAPA）作为首个获批的钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）抑制剂，通过减少肾脏葡萄糖重吸收、促进葡萄糖排泄而改善血糖控制，同时具有减轻体重和改善心血管状况的作用。确保DAPA药品的纯度、浓度和稳定性需要有效的分析方法。目前文献中报道的DAPA测定方法主要包括高效液相色谱（HPLC）、高效薄层色谱（HPTLC）和伏安法，而毛细管电泳（CE）方法仅有一篇用于同时测定DAPA与其它药物的报道。CE技术因样品和溶剂用量少、废物产生量低、背景电解质（BGE）多为水相而有机溶剂使用量大幅减少，且能耗较低，更符合绿色分析化学（GAC）原则。然而，CE也面临重现性方面的挑战，需通过方法优化和毛细管条件控制来克服。

材料与方法

仪器与分析条件：使用Agilent 3DCE系统，配备自动进样器、光电二极管阵列检测器和温度控制器。采用熔融石英毛细管（内径50 μm，总长48.5 cm，有效长度40 cm）。新毛细管依次用1.0 M NaOH冲洗15分钟、纯水冲洗10分钟进行活化。每次使用前依次用0.1 M NaOH冲洗5分钟、纯水4分钟、BGE冲洗5分钟进行条件化。两次进样间用0.1 M NaOH冲洗3分钟、纯水1.5分钟、BGE 3分钟进行再条件化。每日使用后用水冲洗并干燥以防堵塞。BGE为40 mM四硼酸钠溶液，pH调至10.5。电泳条件优化为：电压14 kV（电流约52 μA），温度25°C， hydrodynamic进样50 mBar、5秒，检测波长230 nm。

化学品与试剂：DAPA标准品（纯度98.4%）购自Ontario Chemical（加拿大），DAPA 10 mg片剂（Forxiga，阿斯利康）购自本地市场。其他试剂如磷酸二氢钠、硼酸、TRIS–HCl缓冲液、四硼酸钠、氢氧化钠、盐酸、乙腈等购自Sigma-Aldrich（德国）。超纯水用于溶液配制。内标（IS）雷尼替丁（纯度99.9%）购自美国药典（USP）。

储备溶液制备：DAPA储备标准溶液用乙腈配制，浓度1000 μg·mL^?1。IS溶液同样用水配制为1000 μg·mL^?1。样品溶液制备：精密称取20片DAPA片粉，取相当于10 mg DAPA的粉末至10 mL容量瓶，乙腈溶解，超声30分钟，定容。安慰剂溶液按制剂辅料（微晶纤维素、乳糖等）常用浓度配制，方法同样品溶液。所有工作溶液用BGE稀释至终浓度75 μg·mL^?1，并经0.45 μm滤膜过滤。预处理溶液（0.1 M NaOH、水和BGE）同样过滤。

方法验证：根据USP和国际协调委员会（ICH Q2(R1)）指南，对专属性、线性、检测限（LOD）和定量限（LOQ）、精密度、准确度和耐用性进行验证。所有标准溶液和样品溶液在进样前均加入固定浓度的IS以确保定量过程的准确性和重现性。

专属性：通过评估辅料和降解产物（酸、碱、氧化、光解和热应激条件下产生）的干扰来考察专属性。化学降解：储备溶液与1 M HCl、1 M NaOH或3% H₂O₂混合。光稳定性测试在UVA（352 nm）和UVC（254 nm）光（200 Wh·m^?2）下进行，热应激在60°C密闭瓶中进行。样品每小时收集一次，持续5小时，调整至75 μg·mL^?1，中和（必要时），过滤后进样。通过比较DAPA/IS峰面积比与标准质量参考（SQR）来评估降解，确认方法的可靠性和准确性。

线性与LOD和LOQ：通过三个标准曲线（浓度50、75、100、125、150和175 μg·mL^?1，各三点，IS浓度固定为75 μg·mL^?1）确定线性。线性回归通过方差分析（ANOVA）确定。LOD和LOQ通过校准曲线截距的标准偏差（σ）和斜率（S）计算：LOD = 3.3(σ/S)，LOQ = 10(σ/S)。

精密度：通过重复性（日内）和中间精密度（日间）研究确定，计算DAPA样品溶液（100 μg·mL^?1）与IS（75 μg·mL^?1）峰面积比的相对标准偏差（RSD）。六个DAPA样品溶液单独制备并各进样三次。

准确度：通过在样品溶液（恒定浓度100 μg·mL^?1）中添加已知量DAPA标准品（25、50和75 μg·mL^?1）进行回收率试验，IS浓度固定为75 μg·mL^?1。各溶液制备三份、各进样三次。回收率百分比按以下公式计算：回收率(%) = (C_found ? C_sample)/C_added × 100，其中C_found为加标样品测得浓度，C_sample为未加标样品浓度，C_added为添加标准品浓度。

耐用性：通过微变参数（毛细管温度23–27°C、进样时间4–6秒、施加电压13.5–14.5 kV）评估，响应结果（DAPA/IS相对面积）与正常条件比较。

绿色度评估：使用分析绿色度指标（AGREE）评估所建立CE方法与文献报道HPLC方法的绿色度，通过开源软件生成象形图（分数0–1）。

结果与讨论

方法开发：初步方法开发聚焦于选择合适BGE以确保可靠检测。评估了多种BGE（磷酸二氢钠、硼酸、TRIS–HCl和四硼酸钠），浓度10–50 mM，pH 4–11。初步实验显示在非碱性pH下峰形宽、强度低、不对称，仅四硼酸钠（40 mM，pH 10.5）产生尖锐、强峰，最适合进一步优化。pH 10.5的选择基于DAPA的理化性质（糖苷部分羟基pK_a约12.57），此时分析物主要呈中性形式（仅约0.85%去质子化），碱性pH旨在增强电渗流（EOF），促进中性或弱电离物种迁移，且四硼酸阴离子可与分析物糖苷部分可逆络合，改善迁移行为。但初始条件电流高（20 kV时79.8 μA），导致焦耳热、重现性降低和毛细管降解风险，通过调整电压、BGE浓度和毛细管温度降低电流而不影响分析性能。最终优化条件见表1。

内标选择：在确定最佳BGE后选择IS。测试了氨苄西林、阿替洛尔、布比卡因、林可霉素、氯喹和雷尼替丁。图2显示DAPA与IS雷尼替丁的电泳图，后者峰形对称、迁移时间一致、在230 nm无干扰，确保DAPA/IS面积比重现性，适用于定量分析。系统适用性通过连续五次进样含DAPA和IS各75 μg·mL^?1的标准溶液评估，方法表现优异：DAPA理论板数24255，峰对称因子1.01， analyte与IS基线分离（R_s = 5.4），RSD低于5%，确认分析系统精密度和可靠性。迁移时间约IS 5分钟、DAPA 6.5分钟。

方法验证

专属性：安慰剂溶液分析显示商业产品中辅料对DAPA定量无干扰（图2）。所有应激条件下电泳图视觉分析未显示额外降解峰，但定量显示碱降解（近50%）和氧化降解（约20%）后含量下降，而热、辐射和酸环境下含量下降不明显。图3显示了各强制降解条件下药物浓度衰减。使用DAD和ChemStation软件评估峰纯度，UV–vis光谱相关系数近1，确认峰均质性和无共洗脱，支持方法专属性。虽未观察到明显降解峰，可能反映了对低水平杂质灵敏度有限，但验证确认DAPA/IS比值的日内和日间精密度满意，应激条件下该比值显著降低进一步证明分析物降解。

线性和LOD与LOQ：标准曲线回归方程y = 0.0285x ? 0.2101，R² = 0.999，显示DAPA浓度与响应间线性关系（图4）。残差分析显示正态分布，无异常样本，标准化残差均在+2和?2之间。ANOVA检验结果满意，表明方法在50–175 μg·mL^?1浓度范围内具线性。LOD和LOQ分别为6.2和18.8 μg·mL^?1（σ = 0.0536）。方法在LOD和LOQ水平能检测和定量分析物，精密度可接受（RSD < 5%，n = 5），经五次重复进样确认（图5）。

精密度：精密度经18次进样确认，RSD约2.5%。表2显示了精密度研究结果，同一日内（重复性，n = 6）和不同日间（中间精密度，n = 18）变异性低，DAPA的日内和日间RSD值在可接受限内，确认所提出CE方法的精密度和可靠性。

准确度：方法准确度可接受，DAPA回收率平均102.72%（测试浓度125、150和175 μg·mL^?1，均在校准范围内），无信号饱和或非线性（表3）。

耐用性：通过微变温度、进样时间和施加电压评估耐用性。表4显示这些条件与标准（未修改）参数比较，相对面积值（DAPA/IS）在所有条件下一致，表明此类波动未显著影响方法性能。先前优化的参数（如pH、BGE组成和浓度）因影响EOF而进一步强调了稳健和良好控制系统的重要性。

CE方法与HPLC的性能和绿色度比较

所提出CE方法与先前报道的HPLC方法进行统计比较。基于重复性数据（n = 18）和未配对Student t检验，两种方法准确度相当，平均回收率分别为97.44%（CE）和96.74%（HPLC），无显著差异（p = 0.2463），确认分析等效性（表5）。尽管CE方法显示更大方差（5.71 vs. HPLC 0.55），但这未损害其准确度或精密度，反映在相似平均回收率中。除分析性能外，比较了操作和环境方面。尽管HPLC分析更快（约快三倍），但需要更高溶剂消耗、昂贵仪器和产生相当废物。相反，CE尽管准备和分析时间较长，但更经济和环境可持续，使用最少试剂体积、产生更少废物，这些特性符合GAC原则（表6）。为进一步评估环境影响，AGREE指标应用于两种方法。该工具基于GAC 12项原则，生成彩色象形图，分数0–1，反映整体绿色度。如图6所示，HPLC最低分与乙腈使用及相关废物有关（原则7和10–12），而CE唯一显著缺点是其较低通量（原则8）。CE方法获得更高AGREE分数（0.80 vs. HPLC 0.71），强调其优越环境 profile。尽管使用潜在危险溶剂，但CE方法使用量极少，在BGE中稀释，大幅减少环境影响，结合低废物产生和溶剂消耗，突出CE在保持分析性能的同时符合绿色化学。

结论

CE开发的DAPA测定方法对所有分析验证参数（专属性、线性、精密度、准确度、耐用性和灵敏度限）表现满意。与HPLC相比，CE因溶剂使用、能耗和废物产生减少而提供更大可持续性和成本效益，经绿色化学指标确认。然而，CE存在分析时间较长、通量较低和灵敏度较低的问题，可能限制其在痕量分析中的应用。尽管有这些限制，该方法展示了准确、精密和选择性定量DAPA的能力，使其成为药物常规分析的合适选择，特别是在优先考虑可持续性和操作经济性的环境中。