EefR突变通过激活AcrB缺失大肠杆菌中的隐性多药外排泵驱动血根碱耐药性

　　本研究发现AcrB缺失的大肠杆菌通过EefR（TetR家族转录调节因子）突变激活隐性多药外排泵EefABC（RND型）和EefD（MFS型），从而产生对血根碱（SAN）及多种抗生素的交叉耐药。该机制广泛存在于肠杆菌科中，且基因簇可质粒传播，对临床耐药防控及植物源抗菌剂（如博落回提取物）的应用安全具有重要警示意义。

　　

ABSTRACT

抗生素耐药性已成为全球健康的重大威胁。深入研究细菌抵抗多种胁迫因素的进化机制，对于制定有效应对策略至关重要。本研究旨在阐明AcrB缺陷型大肠杆菌ATCC 35218（35218m）对博落回（Macleaya cordata）主要生物碱成分血根碱（SAN）的适应机制。通过体外筛选35218m的SAN耐药克隆，发现了一个功能未表征的TetR调节因子EefR。该调节因子抑制其自身及四个相邻基因（形成eefRABCD操纵子）的表达，这些基因编码三联RND外排泵（EefABC）和一个推定的MFS型输出蛋白（EefD）。这些泵的过表达降低了acrB缺陷型大肠杆菌对SAN及结构多样抗生素的敏感性。eefR-eefABC-eefD基因簇广泛分布于肠杆菌科基因组中，并在多个大肠杆菌分离株的质粒上发现，表明该多药耐药机制存在快速传播的显著风险。

Introduction

抗生素耐药危机对21世纪全球公共卫生安全构成重大威胁。据统计，全球每年约有127万人直接死于耐药菌感染，预计到2050年，其死亡率将超过癌症。这一严峻形势与医疗、畜牧及农业领域抗生素的过度使用密切相关。畜牧养殖中长期使用抗生素已被认为是抗菌素耐药基因出现和水平传播的关键驱动因素，促使全球自2006年起限制抗生素生长促进剂（AGPs）的使用。在此背景下，植物源植化素作为AGPs的潜在替代品，在畜牧生产中的应用日益受到关注。

博落回提取物及其主要生物碱血根碱（SAN）因其对 zoonotic 病原体的广谱抗菌特性，被广泛应用于畜牧生产。近期研究表明，单次暴露于含SAN的植物源抗菌剂不会导致抗生素耐药基因传播。然而，在反复亚抑制浓度SAN暴露下，已发现大肠杆菌的多药耐药突变株。全基因组测序鉴定出TetR家族转录调节因子（marR/acrR）的功能缺失突变是主要分子决定因素，其通过解除对该RND型转运系统的抑制，驱动AcrAB-TolC外排复合体的过表达。acrB基因的破坏导致大肠杆菌对SAN的最低抑菌浓度（MIC）降低16倍。这一发现阐明了AcrAB-TolC在介导对SAN的固有和适应性耐药中的双重作用，并凸显了联合使用外排泵抑制剂的治疗潜力。

尽管acrB缺陷型大肠杆菌突变株对SAN表现出比野生型更高的敏感性，但这些突变株产生耐药回复突变倾向升高。这种倾向不仅促进耐药基因的产生和传播，也影响与外排泵抑制剂联合治疗的疗效。为获取更多关于SAN对细菌耐药性影响的信息，本研究选用acrB缺陷的E. coliATCC 35218突变株（35218m）进行实验。通过一步法筛选分离出稳定的SAN耐药突变株，并测定其对不同抗生素的交叉耐药性。结合全基因组测序、基因敲除、定量实时PCR（qRT-PCR）和转录组学分析，详细研究了SAN诱导抗生素耐药的机制。该耐药性的主要原因为一个功能未表征基因BGPOLHDB_02578的突变，该基因编码TetR家族调节因子EefR。EefR抑制其自身及四个相邻外排泵基因在大肠杆菌中的表达。该结果将有助于进一步理解植物化学物诱导的抗生素耐药性传播。

Materials and methods

Bacterial strains, plasmids, and chemical reagents

本研究使用的菌株和质粒见表S1。大多数菌株源自35218m，即acrB缺陷的E. coliATCC 35218突变株。LB培养基（NaCl 5.0 g/L；酵母提取物5.0 g/L；胰蛋白胨10.0 g/L；pH 7.0）用于细菌常规培养，MH培养基（Oxoid, UK）用于药物敏感性评估。除非特别说明，所有培养物在37°C孵育18至24小时。需要时，使用适当抗生素进行质粒筛选和维持，浓度如下：氨苄青霉素100 μg/mL，四环素20 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL。SAN（>98%）购自上海麦克林生化科技有限公司（中国）。其他化学品和抗生素购自Sigma-Aldrich（美国）或阿拉丁生化科技有限公司（上海，中国）。

Drug susceptibility test

采用微量肉汤稀释法测定微生物的抗菌敏感性，操作遵循CLSI 2018指南。简要而言，将抗菌剂在96孔微孔板中进行连续两倍稀释，加入等体积标准化至约1.0 × 10⁶ CFU/mL的菌悬液。微孔板在37°C有氧条件下孵育18–20小时。MIC定义为在测试条件下能抑制微生物可见生长的最低抗菌剂浓度。

Mutants selection and whole genome sequencing

采用一步法筛选分离SAN耐药克隆。简要而言，将约3 × 10¹⁰ CFU/mL的35218m菌悬液100 μL涂布于含不同浓度SAN（4至64 μg/mL）的LB平板上。所有平板在37°C孵育48–96小时。孵育后，随机挑取单个菌落，在无药LB平板上纯化，并通过MIC测定评估其对SAN的敏感性。随机选取两个菌落（命名为S1和S2）进行进一步研究。使用ZR Fungal/Bacterial Genomic DNA ExtractionKit（Zymo Research Corp, Orange, CA, United States）提取SAN耐药突变株及其亲本株的基因组DNA。为确定突变位点，进行全基因组序列分析。

Gene knockout and complementation

利用CRISPR-Cas系统构建eefR缺陷的35218m（ΔeefR）。由于耐药性问题，将原始质粒pTargetF中的壮观霉素抗性替换为四环素抗性。使用网站（http://crispor.gi.ucsc.edu/）设计sgRNA序列（GCTGGCAATTTGCGACATACTGG），靶向eefR基因的NGG PAM位点。构建含新N20序列（GCTGGCAATTTGCGACATAC）的pTargetF（tetR）质粒。设计包含AseI限制性位点和三个串联终止密码子的单链DNA修复寡核苷酸。通过电穿孔将pTargetF-eefR质粒和ssDNA片段导入35218m-pCas感受态细胞。在含卡那霉素和四环素的双抗生素平板上筛选重组菌落。

为进行ΔeefR的功能互补，从35218m染色体DNA中扩增eefR基因，并将其插入质粒pBR322中。经PCR和DNA测序确认后，将重组质粒pBReefR转化入ΔeefR，生成菌株CΔeefR。采用相同方法将野生型eefR基因导入S1和S2菌株，分别得到S1-CeefR和S2-CeefR。本研究使用的引物见表S2。

Measurement of gene expression

使用TRIzol? Reagent（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）从35218m及其SAN耐药突变株的对数生长期（OD₆₀₀为0.5）提取总RNA。使用Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific, USA）测定RNA浓度和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。对于RNA测序，使用Ribo-Zero magnetic kit（Epicenter Biotechnologies, Madison, WI, United States）从总RNA中去除核糖体RNA。由上海领格生物科技有限公司进行文库构建和基于HiSeq4000（Illumina, Inc., USA）的RNA测序。对于qRT-PCR，使用Evo M-MLV RT Mix Kit（Accurate Biology, Hunan, China）合成cDNA。使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qRT-PCR Kit（Accurate Biology, Hunan, China）在qTOWER3G PCR系统（Analytik Jena AG, Germany）上进行qRT-PCR。每个靶基因的表达水平以16S rRNA基因的表达水平进行标准化。qRT-PCR引物见表S3。

Protein expression and purification

从35218m中PCR扩增eefR编码区，并将其克隆到pET28a (+)表达载体中，构建C端His标签的重组蛋白（pET28a-eefR）。在E. coliBL21 (DE3)中异源过表达重组蛋白。将BL21 (DE3)过夜培养物以1%接种量接入新鲜LB培养基，37°C、150 rpm振荡培养4小时。加入终浓度为1 mM的IPTG，25°C诱导表达12小时。离心收集菌体，重悬于Tris缓冲液（50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5% glycerol, pH 8），冰上超声破碎。离心取上清，加入预平衡的Ni-NTA树脂（Ni Bestarose FF, Jiaxing, Zhejiang, China）。用含10–60 mM咪唑的Tris缓冲液洗涤树脂，再用含120 mM咪唑的Tris缓冲液洗脱。通过SDS-PAGE评估纯化蛋白纯度，并使用抗His标签抗体（HA1006, Hangzhou, China）通过Western blot确认目标蛋白。

Electrophoretic mobility shift assay

采用非放射性电泳迁移率变动分析（EMSA），使用长度为129 bp、位于eefR启动子区域上游的生物素标记DNA片段。使用表S2所列引物进行PCR扩增，获得生物素化和非生物素化探针。将含有DNA探针和不同摩尔浓度EefR蛋白的EMSA反应混合物在结合缓冲液中25°C孵育20分钟，然后在4°C下通过6%非变性PAGE凝胶进行电泳分离。电泳后，按照EMSA试剂盒（Beyotime, Shanghai, China） protocol将凝胶转移至带正电荷的尼龙膜上。使用ChemiDoc成像系统观察结果。

Measurement of green fluorescent protein expression

通过Gibson组装构建基于pBR322的GFP报告质粒。使用引物对gfp-F和gfp-R从pGFPuv质粒扩增gfp基因。使用引物对pBR-GFP-F/R和P_eefR-F/R分别扩增pBR322和eefR上游启动子区域（P_eefR）的Gibson组装片段。将所得PCR产物组装，得到质粒pBR-P_eefR-GFP。通过从35218m菌株中扩增eefR基因（引物eefR-F2/R2），并将其插入pBR-P_eefR-GFP质粒，构建pBR-P_eefR-GFP-EefR。该质粒携带P_eefR启动子驱动GFP表达，四环素启动子驱动eefR基因表达。基于质粒pBR-P_eefR-GFP-EefR，使用引物S1-F/R和S2-F/R构建质粒pBR-P_eefR-GFP-EefR^S1和pBR-P_eefR-GFP-EefR^S2。这些构建体中，编码EefR^S1和EefR^S2的基因分别源自35218m突变株S1和S2。将这些表达质粒转化入E. coliDH5α、35218m或ΔeefR。

为定量GFP表达，将细菌培养至对数期，用PBS缓冲液洗涤，重悬至OD₆₀₀约为1。使用SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）在激发波长395 nm、发射波长509 nm下分析GFP荧光。

Cloning of the efflux pump genes

使用无缝克隆将目标基因序列插入载体片段，构建基于pBR322的质粒；两端均带有约20 bp的同源序列。使用引物对pBR-F1/pBR-R1、pBR-F1/pBR-R2、pBR-F1/pBR-R3和pBR-F2/pBR-R4分别扩增pBReefAB、pBReefABC、pBReefABCD和pBReefD的载体片段。使用引物对eefA-F/eefB-R、eefA-F/eefC-R、eefA-F/eefD-R1和eefD-F/eefD-R扩增上述四个质粒的目标基因序列。所有目标基因均插入pBR322质粒骨架中四环素抗性基因启动子的下游。通过热激转化将四个质粒导入E. coliDH5α ΔacrB，并进行后续实验。通过PCR和Sanger测序确认构建体。

Distribution analysis of bacteria harbouring the eefR-eefABC-eefDgene cluster

将E. coliATCC 35218的eefRABCD基因簇核酸序列在NCBI网站上进行BLAST比对和搜索，筛选条件设置为覆盖率≥99%且序列一致性≥90%。从筛选结果中获得2976株具有完整基因组的细菌菌株用于后续分析。对数据集中的菌株进行来源分析，将其分类为人类相关、动物相关或环境相关。使用ClermonTyping工具（http://clermontyping.iame-research.center）对E. coli菌株进行系统发育分型。基因簇的序列信息见表S5。数据于2025年3月3日从NCBI数据库下载和整理。

Statistical analyses

所有实验均进行三次生物学重复，数据以平均值±标准差表示。使用Graphpad Prism 10（Graph Pad Software, USA）进行统计分析。T检验用于计算p值，显著性差异表示为, p< 0.05; , p< 0.01; , p< 0.001; and , p< 0.0001。

Results

The acrB-deficient 35218m tends to develop multidrug resistance after treatment with SAN

已有报道表明SAN是AcrB的良好底物，AcrB是E. coliAcrAB-TolC三联外排泵的关键底物结合亚基。acrB缺陷的E. coliATCC 35218突变株（35218m）对SAN高度敏感，其MIC比亲本株降低16倍。有趣的是，在药敏试验中，经常在SAN纸片抑菌圈内观察到35218m的生长菌落。为获取更多关于SAN对细菌耐药性影响的信息，通过在含不同浓度SAN的平板上进行一步法筛选，分离出35218m的抗生素耐药突变株。在含32 μg/mL SAN的平板上，耐药突变株的产生频率约为0.5 × 10^?7。随机分离两个菌落（S1和S2）进行进一步研究。35218m对SAN的MIC为1 μg/mL，而所有突变株的耐药性均增加，MIC为8 μg/mL。两种突变株在无药LB中的生长行为与亲本株35218m无显著差异，且其对SAN的耐药性在无药琼脂上传代三次后保持稳定。还测定了突变株对一系列标准抗生素的敏感性，结果显示其对红霉素、氯霉素、夫西地酸、克林霉素和地喹氯铵的MIC比亲本株增加≥4倍，而对卡那霉素和多粘菌素B未观察到此类增加。值得注意的是，对具有功能性AcrB的野生型E. coliATCC 35218进行一步法筛选，难以产生稳定的耐药突变株。

Mutation in eefRis responsible for the multidrug resistance of the mutant strains

对两个突变株进行全基因组测序。与亲本株相比，两个突变株在一个共享基因BGPOLHDB_02578（eefR）上均出现错义突变，该基因注释为编码一个含螺旋-转角-螺旋结构域的蛋白。具体而言，S1在eefR基因组位置2,770,391处存在C到T的转换，导致氨基酸改变（Val45Glu），而突变株S2在基因组位置2,770,377处存在G到T的转换（Arg50Ser）。随后通过PCR扩增和测序证实了每个变异。随后从含32 μg/mL SAN的平板上挑取另外五个SAN耐药分离株，发现这些突变株的eefR基因均含有错义和/或移码突变。

为验证eefR参与SAN耐药，创建了35218m的缺失突变株（ΔeefR）及其互补株（CΔeefR）。测定这些菌株的MIC。结果表明，eefR的缺失导致35218m对SAN的耐药性显著增加，MIC与耐药突变株中观察到的相当。相反，将WT eefR导入ΔeefR完全恢复了对SAN的敏感性。几种其他抗菌药物对eefR缺陷或互补株敏感性的变化与对SAN观察到的变化相似。这些结果表明EefR正常功能的丧失可能是分离的突变株多药耐药（MDR）的原因。有趣的是，当将WT eefR导入S1或S2时，对植物化学物和其他抗生素的敏感性仅部分恢复。对此现象的一种可能解释是，在S1和S2菌株中鉴定出的eefR错义突变充当显性负性突变，从而干扰了野生型EefR蛋白的功能。

EefR is an uncharacterized TetR regulator and regulates its own expression

EefR包含188个氨基酸，理论分子量为21.79 KDa。根据SMART分析，预测EefR在N末端（氨基酸16–62）有一个可能的DNA结合HTH motif，在C末端有一个推定的配体结合结构域。NCBI服务器中的BLAST搜索结果显示，EefR与许多E. coli菌株中注释为TetR/AcrR家族转录调节因子的多个蛋白高度相似（氨基酸一致性>99%，覆盖率100%）。然而，在一致性最高的序列中，没有一个经过功能表征，使得EefR成为本工作中第一个进行功能表征的蛋白。使用PRALINE服务器与已表征的TetR调节因子序列进行比对，显示EefR与E. coliUidR/GusR序列一致性最高（21%），并且在DNA结合结构域中比在配体结合结构域中共享更多保守的氨基酸残基。尽管系统发育分析表明EefR是一个独特的实体，在系统发育树中形成一个独立的分支，但通过AlphaFold3获得的模型结构表明EefR由九个α-螺旋组成，这是大多数TetR家族成员的一个重要特征。

已证明TetR调节因子具有自动调节特性。通过qRT-PCR分析观察到，与亲本株35218m相比，突变株S1和S2中eefR水平显著上调。为进一步检验EefR控制自身表达的假设，通过将eefR上游约316 bp的片段克隆到无启动子质粒pBR322中的gfp报告基因前面，创建了eefR的启动子-报告基因构建体（pBR-P_eefR）。另外，使用pBR-P₀作为阴性对照，其在gfp前没有启动子。将eefR启动子与gfp融合后，在E. coliDH5α中观察到表达，荧光强度比阴性对照高约10倍。正如预期，随后引入WT eefR抑制了gfp表达，这些细胞与阴性对照细胞之间的荧光强度无显著差异。相反，引入来自S1或S2的Val45Glu或Arg50Ser突变型eefR，对含有质粒pBR-P_eefR的E. coliDH5α中的gfp表达没有抑制作用。值得注意的是，Val45和Arg50位于预测的EefR α3-螺旋区域，该区域已被确定为TetR调节因子与DNA相互作用的重要元件。这些结果表明EefR抑制其自身启动子的表达，从而表现出负向自动调节。与此结论一致的是，当用质粒pBR-P_eefR转化时，ΔeefR中的GFP荧光值显著升高，而与pBR-P₀相比，亲本株35218m中没有观察到显著变化。

EefR binds to a palindromic sequence upstream of eefR

已知TetR调节因子结合到其调控基因上游区域的反向重复序列。对eefR上游区域的分析发现，在基因上游存在一个回文序列（TGAGAACGATCATTCTCA）。为确认EefR直接结合该区域，使用eefR上游DNA片段和纯化的EefR蛋白进行EMSA。将eefR基因克隆并在E. coliBL21(DE3)中受T7启动子控制过表达，使用Ni-NTA树脂纯化C端His标签蛋白。将重组蛋白与源自eefR基因上游区域、含有回文序列的129 bp DNA探针（P1）混合。结果显示，增加纯化EefR的量使DNA探针的迁移发生偏移，并观察到DNA-蛋白质复合物。该结合具有高度特异性，因为加入相应未标记P1（冷探针）的浓度增加会阻碍DNA-蛋白质复合物的形成，而非特异性探针（eefR基因下游区域的148 bp DNA片段）则不会。此外，对于缺少回文序列的P1（P2），未观察到DNA-蛋白质复合物，说明了特定序列对EefR识别的重要性。

通过生成一系列在回文序列内包含单个或多个点突变的DNA探针，进一步阐明了回文motif在介导EefR特异性结合中的作用。将形成回文所必需的一侧核苷酸序列通过将核苷酸A/T转换为G/C（或反之）进行替换。与野生型DNA探针相比，包括单个碱基替换在内的突变，即使在最高蛋白浓度下，在EMSA中也未表现出显著偏移。这些发现进一步证实了EefR蛋白高度特异性地识别和结合eefR启动子区域内的反向重复序列。

随后，在E. coliATCC 35218基因组中搜索了潜在的EefR靶标。使用18-bp回文序列（TGAGAAN5TTCTCA）作为输入，通过MEME Suite中的MAST工具扫描E. coli基因的可及上游区域。对其他基因上游区域的搜索未发现类似重复序列的证据，这表明EefR的调节仅通过结合其自身启动子区域直接介导。

EefR regulates the expression of four neighboring efflux pump genes that form an operon with eefR

由于已知大多数TetR成员是其相邻基因的调节因子，随后分析了eefR的周围序列。如图所示，eefR基因与四个成簇的相邻基因eefABCD的转录方向相同。基于序列相似性，eefA、eefB和eefC分别被提议编码周质衔接蛋白、内膜RND转运蛋白和外膜通道蛋白，它们共同构成一个三联RND外排泵（EefABC）。此外，eefD被推测为一个推定的MFS型药物输出蛋白基因。基因组织和功能连通性表明这五个基因构成一个共转录单元。正如预期，当使用cDNA作为模板时，所有五个基因间区域均被成功扩增，该cDNA是从S1培养细胞的总RNA反转录而来，表明eefR、eefA、eefB、eefC和eefD基因组成一个操纵子，并作为一个单元共转录。

为确定EefR对相邻基因表达的影响，通过qRT-PCR评估了这些外排泵基因在eefR缺陷突变株及其具有WT eefR基因的亲本株中的表达水平。正如预期，eefR的破坏显著增强了四个外排泵基因的表达。例如，通过qRT-PCR对eefA、eefB、eefC和eefDmRNA水平的定量显示，ΔeefR菌株中分别比其亲本对照35218m增加了83倍、28倍、43倍和27倍。在S1和S2突变株中，相对于亲本株，这些基因观察到类似的上调模式。这些结果与上述eefRABCD操纵子作为一个单元共转录一致，并表明EefR作为负调节因子发挥作用，不仅抑制其自身转录，还抑制四个相邻基因的表达。

The overproduction of EefABC and/or EefD results in multidrug resistance in E. coli

将四种外排蛋白与TCDB中的转运蛋白进行比对，显示EefA、EefB和EefC与Enterobacter aerogenes中RND外排系统EefA、EefB和EefC的组分相似性最高，序列一致性分别为78.1%、87.3%和74.9%；而EefD与Mycobacterium smegmatis的MFS外排泵MSMEG_2991和E. coli的Bcr相似性最高，序列一致性分别为36.7%和30.1%。已有研究表明，表达来自多拷贝质粒的EefABC外排泵的E. aerogenesΔacrA，对包括氯霉素、诺氟沙星、环丙沙星、红霉素、四环素和多西环素在内的广谱抗生素产生MDR。类似地，在E. coli中过表达MSMEG_2991导致对结构不相关抗生素组的耐药性升高。基于这些发现，可以提出三联外排泵EefABC和/或MFS泵EefD的过表达可能导致MDR。

为确定eefABCD是否能赋予耐药性，构建了四个质粒pBReefABCD、pBReefABC、pBReefAB和pBReefD，并将其转化入E. coliDH5α ΔacrB。pBR*