基于酶活性可视化技术原位鉴定人肠道菌群中番泻苷A还原功能菌群

　　本刊推荐：本研究开发了一种酶活性可视化平台，通过设计底物探针（ABPs）靶向肠道微生物中的同工酶，结合荧光激活细胞分选（FACS）和16S rRNA测序技术，首次实现了对复杂菌群中番泻苷A（SA）还原功能菌群的原位鉴定、分离及功能验证。该技术突破了传统基因组学和培养方法的局限，为微生物组功能研究提供了强大工具。

　　

引言：人类肠道微生物组在健康与疾病中扮演关键角色，其功能实现依赖于空间组织化、分类学多样且代谢互动的功能菌群（Functional guilds）。尽管宏基因组学技术的发展揭示了微生物的潜在功能，但约50%的基因功能未知，且基因存在与否不能直接反映其功能活性。传统培养方法由于大部分肠道微生物难以体外培养，限制了功能微生物的发现。因此，开发能够原位研究微生物功能的方法具有重要意义。

方法：研究选取了12种系统发育多样的肠道微生物，包括Bifidobacterium pseudocatenulatum、Clostridium butyricum等，通过LC-MS/MS评估其番泻苷A还原活性。利用AlphaFold预测酶结构，分子对接和分子动力学（MD）模拟分析酶-底物相互作用。通过异源表达和纯化获得BpNfrA和StNfrA酶，进行酶动力学测定和生物膜干涉（BLI）实验。设计合成了两种番泻苷A基探针SAP1和SAP2，用于酶和细菌标记。结合CuAAC反应、荧光成像、流式细胞术（FACS）和蛋白质组学分析，验证探针的特异性和应用效果。

结果：

番泻苷A还原活性表征

研究发现5种菌株具有较高的番泻苷A还原活性，包括Bifidobacterium pseudocatenulatum、Clostridium butyricum等。选择4株阳性菌和3株阴性菌作为模型菌株。

BpNfrA作为模型酶的特性

BpNfrA通过"ping-pong"机制催化番泻苷AC10-C10'键的还原裂解。酶动力学显示K_m为43.5 μM，k_cat为5.4 min^-1。MD模拟表明系统在40 ns后稳定，Arg20和Arg219是关键结合残基。BLI证实番泻苷A与BpNfrA直接结合，K_D为282 μM。

ABPs-FACS平台的建立与优化

设计的SAP1和SAP2探针含有不同反应基团和生物正交基团。SAP2对BpNfrA的标记具有浓度和UV依赖性，且可被番泻苷A竞争抑制。在细菌水平，SAP2能特异性标记C. butyricum等活性菌株，而阴性菌株E. coli等标记信号弱。竞争实验和双香豆素抑制实验证实了探针的特异性。蛋白质组学分析发现标记的蛋白可能为氧化还原酶或ABC转运蛋白。

SAP2对番泻苷A还原菌的筛选

流式分析显示，阳性菌株C. butyricum、B. breve和R. gnavus的Cy5⁺比例分别为95.8%、99.6%和99.2%，而阴性菌株A. muciniphila、E. coli和L. brevis分别为22.9%、4.5%和5.34%。人工菌群实验证实SAP2结合FACS能有效分离代谢和非代谢菌。

人肠道菌群中番泻苷A还原菌的鉴定

对人粪便菌群进行SAP2标记和FACS分选，Cy5⁺群体中Clostridium、Streptococcus、Bacteroides和Limosilactobacillus丰度较高。从阳性群体中鉴定出Streptococcus thermophilus、Limosilactobacillus reuteri等具有番泻苷A还原活性。

酶活性机制的验证：以S. thermophilus为例

在S. thermophilus中发现了BpNfrA的同源物StNfrA（序列一致性45%）。StNfrA能催化番泻苷A还原，K_m为60.4 μM，kcat为12.4 min^-1。MD模拟显示系统在50 ns后稳定，Arg43、Arg104等是关键结合残基。BLI显示番泻苷A与StNfrA结合紧密，K_D为66.9 μM。

讨论：本研究首次证实硝基还原酶（NTRs）在番泻苷A代谢中的关键作用，开发了基于酶活性可视化的功能菌群鉴定平台。研究发现酶的存在是细菌代谢活性的必要条件但非充分条件，细菌表面膜蛋白等因素也影响其功能。光亲和基团的引入提高了检测的广谱性，但也可能产生非特异性标记。该技术为研究微生物组功能提供了新方法，未来可用于发现更多药物代谢酶及其宿主菌。