植物生产的帕博利珠单抗糖基化工程增强FcRn结合并延长小鼠血清半衰期

　　本研究针对免疫检查点抑制剂帕博利珠单抗（Pembrolizumab）因血清半衰期短需频繁给药的问题，通过植物糖基化工程技术构建了四种糖变体（Pembro-WT、Pembro-KD、Pembro-NG、Pembro-XF），系统评估了其糖型特征、PD-1结合活性及FcRn亲和力。结果表明，核心岩藻糖/木糖缺陷变体Pembro-XF表现出最高的FcRn结合亲和力及最长的小鼠血清半衰期（45.83 h），显著优于野生型植物表达版本和商业化Keytruda?。该研究为通过糖基化工程优化抗体药代动力学特性提供了新策略，对推动下一代抗体 therapeutics 的开发具有重要意义。

　　

在癌症免疫治疗领域，帕博利珠单抗（Pembrolizumab）作为一种靶向程序性死亡受体1（PD-1）的人源化IgG4单克隆抗体，已被广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗。它通过阻断PD-1与其配体的结合，恢复T细胞功能，从而增强抗肿瘤免疫应答。然而，这类抗体药物存在一个显著临床局限：其血清半衰期较短，患者通常需要每3至6周接受一次给药，以维持有效血药浓度。频繁给药不仅增加了治疗负担和医疗成本，还可能升高免疫相关不良事件（irAEs）的发生风险，影响患者依从性和生活质量。

因此，如何延长抗体药物的半衰期、减少给药次数，已成为提高免疫治疗效果与安全性的关键科学问题。近年来，研究者们逐渐意识到，抗体的Fc段糖基化修饰是影响其体内稳定性的重要因素之一。特别是IgG抗体CH2结构域中Asn297位点的N-糖基化，可通过调节与新生儿Fc受体（FcRn）的相互作用，影响抗体在体内的回收过程，进而决定其半衰期长短。

传统的抗体生产多依赖哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞），其所引入的糖基化模式虽与人类近似，但仍存在成本高、周期长、扩展性有限等问题。相比之下，植物表达系统——尤其是本氏烟草（Nicotiana benthamiana）——因其生长快速、生物量高、易于规模化培养，且适合瞬转表达复杂重组蛋白，已成为颇具潜力的替代生产平台。不过，野生型植物通常会引入β1,2-木糖和α1,3-岩藻糖等非人源糖基结构，这些结构可能诱发免疫原性并加速抗体清除，限制其临床应用。

为此，研究团队借助糖基化工程技术，尝试在植物中生产糖型优化版本的帕博利珠单抗，以期获得更优的药代动力学特性。在这一背景下，来自泰国 Baiya Phytopharm 公司的研究团队开展了一项系统研究，成功构建了四种不同糖型的帕博利珠单抗变体，并对其糖型特征、靶点结合活性、FcRn亲和力及体内药代动力学行为进行了全面评价。该研究最终发表于《Biotechnology Notes》，为植物源抗体药物的糖型优化与半衰期调控提供了重要理论与实践依据。

为完成上述研究，作者团队运用了以下关键技术方法：利用PCR介导的定点突变和载体构建技术获得四种帕博利珠单抗变体的基因序列；通过农杆菌介导的瞬时转染技术在本氏烟草（野生型与ΔXF糖基工程株）中表达抗体；采用Protein A亲和层析纯化抗体；借助LC-ESI-MS技术分析糖基化组成；使用ELISA方法评估PD-1结合活性；采用商业化Lumit?免疫分析法检测FcRn结合能力；并建立ICR小鼠模型进行药代动力学研究，通过尾静脉注射给药并定时采集血清，利用ELISA定量抗体浓度，计算半衰期及药时曲线下面积（AUC）。

3.1. 植物生产的帕博利珠单抗的抗肿瘤活性

研究人员首先在表达人PD-1的转基因小鼠MC38结肠癌模型中评估了植物野生型帕博利珠单抗（Pembro-WT）的抗肿瘤效果。结果显示，Pembro-WT处理组抑瘤效果与商业化Keytruda?相当，肿瘤生长抑制率（TGI_TV）分别达到79.31%和86.55%，且两组均未见明显体重下降或毒性反应。该结果证实植物生产的抗体在体内仍保持完整的生物活性，为后续糖型优化研究奠定基础。

3.2. 帕博利珠单抗变体的糖基化分析

通过LC-ESI-MS技术对四种变体的糖型进行精细解析：Keytruda?主要含核心岩藻糖基化的复合型N-糖（G0F/G1F/G2F）；Pembro-WT则富含植物特异性糖型（如GnGnXF）；Pembro-KD因带有SEKDEL内质网滞留信号而呈现高甘露糖型（Man7–Man9）；Pembro-XF在ΔXF植物中生产，其主要糖型为去岩藻糖/木糖的GnGn结构；而Pembro-NG则因Asn297Ala突变完全去除糖基化。该部分结果成功验证了糖工程策略的有效性与特异性。

3.3. 对人PD-1的结合动力学

所有变体均保留了对PD-1的高亲和力，其半最大效应浓度（EC₅₀）值在28.85–43.56 ng/mL之间，与Keytruda?（20.07 ng/mL）无显著差异。这表明Fc区域的糖基修饰并未影响抗体的抗原结合片段（Fab）功能。

3.4. 对人FcRn的结合动力学

竞争结合实验显示，去糖基化变体Pembro-XF对FcRn的亲和力最高（IC₅₀ = 1.7×10^?2 μg/mL），显著优于Pembro-WT和Keytruda?。这表明去除植物特异性木糖和岩藻糖可显著增强FcRn结合，这可能由于糖链结构的改变优化了Fc与FcRn之间的相互作用界面。

3.5. 植物源帕博利珠单抗变体在小鼠体内的药代动力学

药代动力学研究表明，单次静脉注射后，Pembro-XF的半衰期最长（45.83 h），AUC_0–48值最大（2,758 μg·h/mL），显著优于Keytruda?（33.26 h；AUC_0–48 = 2,227 μg·h/mL）及其他变体。Pembro-KD和Pembro-NG的半衰期居中，而Pembro-WT清除最快。该结果从体内层面证实了糖型优化对抗体持久性的正向调控作用。

综合以上结果，本研究得出以下结论：通过植物糖基化工程策略可成功获得一系列糖型修饰的帕博利珠单抗变体，其中在ΔXF本氏烟草中生产的Pembro-XF变体，因其去除了免疫原性植物糖残基、呈现出人源化GnGn糖型，不仅维持了良好的PD-1结合活性，更表现出增强的FcRn亲和力与显著延长的血清半衰期。

该研究的讨论部分进一步指出，抗体半衰期的延长可能源于植物特异性糖链的去除减少了免疫原性识别与清除，同时GnGn结构更利于FcRn在酸性内吞体环境中的结合与回收。尽管高甘露糖变体（Pembro-KD）和无糖变体（Pembro-NG）在小鼠中未出现预期中的快速清除——可能与物种间甘露糖受体活性差异有关，但它们同样因去除了非人源糖结构而表现出比野生型植物抗体更优的药代动力学特性。

这一研究成果具有多重意义：其一，证明了植物表达系统结合糖基化工程是可实现抗体药物糖型精准调控的有效路径；其二，为改善现有免疫检查点抑制剂的药代动力学性能提供了新思路，未来有望通过类似策略减少给药频率、降低毒副作用；其三，凸显了糖基化在抗体药物开发中的关键作用，为新一代生物制剂的设计与优化提供了理论依据和实践范例。

当然，作者也指出本研究的局限之处，包括目前药代数据仅来自ICR小鼠，其FcRn系统与人类存在一定差异；此外，Pembro-XF在实际肿瘤模型中的疗效优势尚待进一步验证。未来研究可借助FcRn人源化小鼠或非人灵长类模型，更精准地预测其临床转化潜力。尽管如此，该项工作无疑为植物制造的高性能抗体药物的开发奠定了坚实基石。