激活NAMPT通过NAD+/SIRT1/PGC-1α信号通路及NFκB/TNF-α/IL-6调控改善单侧肾缺血再灌注损伤

　　本研究针对急性肾损伤（AKI）缺乏有效治疗手段的临床难题，探索了烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）激活剂SBI797812在肾缺血再灌注损伤（IRI）中的保护作用及机制。研究人员通过体内外实验证实，NAMPT激活可通过提升NAD+水平、激活SIRT1/PGC-1α信号轴促进线粒体生物合成，并抑制NFκB/TNF-α/IL-6炎症通路，显著改善肾功能并减轻组织损伤。该研究为缺血性AKI的治疗提供了新的靶点和策略，具有重要的转化医学价值。

　　

肾脏是人体的重要排泄器官，其血液供应丰富且对缺氧异常敏感。当肾脏血流因手术、创伤或休克等原因发生中断后恢复灌注时，会引发缺血再灌注损伤（IRI），这是临床急性肾损伤（AKI）最常见的原因之一。在重症监护和围手术期医疗中，缺血性AKI发病率高且缺乏特异性治疗手段，主要依靠液体疗法、血管加压药支持及肾脏替代等支持性措施，成为肾病领域面临的重大挑战。

近年来研究发现，细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）耗竭是AKI代谢功能障碍导致不良临床结局的主要原因。在AKI状态下，NAD⁺消耗酶的过度激活导致NAD⁺大量消耗，同时NAD⁺生物合成前体积累及NAD⁺生成受阻，这种恶性循环加剧肾损伤并可能带来长期风险。虽然一些NAD⁺增强疗法如烟酰胺单核苷酸（NMN）、烟酰胺核糖（NR）和烟酰胺（NAM）补充剂在临床前和临床AKI模型中显示出保护作用，但针对NAD⁺生物合成关键酶的靶向治疗策略仍待深入探索。

烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）作为NAD⁺补救途径中的限速酶，在维持细胞NAD⁺平衡中发挥核心作用。该途径主要通过NAMPT催化NAM转化为NMN，随后经烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶（NMNAT）作用生成NAD⁺。SBI797812（SBI）是一种NAMPT激活剂，能增强NAMPT催化效率，提高NMN合成，并通过与NAMPT后通道类似相互作用，解除NAD⁺对酶的抑制，增强NAMPT对ATP的亲和力，保护磷酸化NAMPT，增加焦磷酸副产物的利用，减少NAD⁺的反馈抑制。这种独特的作用机制使SBI区别于其他NAD⁺增强化合物，可能成为更优越的NAD⁺增强候选药物。

线粒体功能障碍在AKI中触发一系列事件，导致氧化应激、ATP耗竭和炎症反应。线粒体缺陷还可激活细胞色素c释放，导致细胞凋亡和炎症，最终引起肾小管上皮萎缩、炎症或坏死，促进肾脏疾病发展。在细胞能量代谢框架内，NAD⁺水平与线粒体生物合成之间的联系极为重要，提高NAD⁺可用性成为改善线粒体功能和治疗代谢疾病的潜在治疗途径。

尽管NAMPT在多种疾病中的作用已被广泛研究，但其在肾IRI中的保护作用及机制尚未明确。考虑到NAD代谢在线粒体功能和细胞对组织损伤的恢复力中的重要性，研究人员开展了本研究，评估SBI在缺血性肾损伤中的治疗效力，检验NAMPT激活通过SBI增强线粒体生物合成、减少氧化应激并改善IRI后肾功能的假设。

本研究采用计算生物学、组织学、免疫组织化学、生物化学和分子生物学等多学科方法，全面探索了SBI作为肾保护剂在缺血性AKI中的应用潜力。FK866（FK）作为一种高效NAMPT抑制剂，能降低细胞NAD⁺水平，被纳入实验设计以验证NAMPT激活在缺血性AKI中的保护作用。

研究人员首先通过计算生物学分析探索NAMPT在肾IRI中作用的分子基础。Venn图分析显示NAMPT相关基因与UIRI相关基因存在764个共享靶点（占总数的12.6%），包括SIRT1、PPARGC1A（PGC-1α）、STK11（LKB1）和PRKAA1（AMPK）等重要调节因子。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析证实NAMPT驱动线粒体DNA代谢过程、NAD⁺生物合成、ATP生产和细胞呼吸，与PGC-1α激活和线粒体生物合成一致的核和线粒体区室。疾病关联分析将NAMPT、SIRT1和PGC-1α映射到肾病理，包括急性肾损伤、肾衰竭和代谢综合征，提供了转化相关性。STRING蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析显示NAMPT、SIRT1、PGC-1α、AMPK、LKB1、NRF1和NRF2之间存在高置信度相互作用，最强预测链接包括NRF1–PGC-1α（0.999）、SIRT1–PGC-1α（0.999）和NAMPT–SIRT1（0.993），强化了NAD⁺依赖性线粒体生物合成轴。

实验研究使用成年雄性Wistar大鼠（250-275克），分为7个处理组：对照组、SBI组（假手术后接受20 mg/kg SBI）、FK组（假手术后接受30 mg/kg FK，每日两次）、UIRI组（单侧肾IR损伤后无处理）、UIRI/FK组（UIRI后接受FK）、UIRI/SBI组（UIRI后接受SBI）和UIRI/SBI+FK组（UIRI后同时接受SBI和FK）。药物剂量基于先前研究选择，能有效改变NAD⁺浓度并在临床前模型中诱导强药理反应。

3.2. 肾组织病理学分析结果

组织学评估显示，对照组、SBI组和FK组保持正常肾小球和肾小管结构，表明SBI和FK单独使用不会诱导结构异常。相比之下，UIRI组表现出明显的肾损伤，包括肾小管变性、间质炎症和坏死。这些特征在UIRI/FK组进一步加重，显示细胞质空泡化、出血、管型形成、肾小管扩张、坏死、肾小管细胞变平和肾小球萎缩，与NAMPT抑制后缺血损伤恶化一致。相反，SBI处理（UIRI/SBI）显著减少肾小管变性、炎症浸润和坏死，支持其通过NAMPT激活的保护作用。然而，SBI和FK联合使用（UIRI/SBI+FK）取消了这些保护效应，肾小管损伤、炎症和坏死水平高于单独SBI处理。

定量分析证实了这些发现：UIRI和UIRI/FK组表现出最高的炎症细胞计数/100μm2和最高的个体及累积变性评分，而UIRI/SBI组显示显著较低的评分，反映肾保护作用。在UIRI/SBI+FK组，这些评分相对于单独SBI显著增加，进一步证明FK对抗NAMPT激活的保护效应并加剧缺血性肾损伤。

补充组织学发现，多种基于图像的分析提供了NAMPT在肾保护中作用的定量和视觉确认。直方图重叠分析量化了每组与对照组的相似性，SBI处理的肾脏（0.961）显示最高重叠，反映保持的结构完整性，而FK单独（0.872）也显示与对照的最小偏差，表明NAMPT抑制在无缺血情况下不扰乱肾形态。相比之下，UIRI显著降低直方图重叠（0.751），与广泛肾小管变性和炎症一致，这种效应在UIRI/FK（0.748）进一步加重。UIRI后SBI处理部分恢复重叠（0.851），而与FK联合使用（0.830）减弱这种保护效应，确认FK对抗SBI介导的保护。

先进成像分析进一步验证了这些趋势。阈值处理、纹理分析和热图映射显示对照组、SBI组和FK组组织良好的肾结构，具有完整组织模式和平衡强度分布。相比之下，UIRI肾脏显示 disrupted 纹理、碎片化组织区域和不均匀强度图，反映严重变性和炎症。这些异常在UIRI/FK强化，而UIRI/SBI显示改善的结构保存和减少的不规则性。然而，UIRI/SBI+FK类似于UIRI单独，确认SBI介导保护的丧失。

3D表面作图提供了组织完整性的空间可视化。对照组、SBI组和FK组显示均匀绿色表面，仅次要峰和谷，指示保存的肾结构。在UIRI中，然而，表面不规则性明显，深谷和亮峰对应坏死、萎缩和炎症。UIRI/FK显示甚至更大的表面破坏，而UIRI/SBI显示部分均匀性恢复和减少的不规则性。再次，UIRI/SBI+FK密切类似于UIRI，确认NAMPT抑制废除SBI的保护效应。

3.3. NAMPT激活减少caspase-3驱动的凋亡和NFκB介导的炎症，而抑制加剧肾损伤

免疫组织化学染色评估cleaved caspase-3（凋亡标记）和NFκB p65（炎症标记）。对照组、SBI组和FK组显示最小染色，具有低棕色DAB信号，指示正常肾组织中可忽略的凋亡和炎症活性。相比之下，UIRI组显示显著增加的caspase-3和NFκB表达，从肾小管和间质区域强烈棕色染色明显，与缺血再灌注损伤后高度凋亡和炎症一致。定量评分确认显著升高染色水平与对照相比。UIRI/FK组显示甚至更强caspase-3和NFκB表达，具有广泛黑暗染色、增加炎症细胞浸润和丰富凋亡细胞，证明NAMPT抑制加剧缺血损伤。相反，SBI处理（UIRI/SBI）显著减少caspase-3和NFκB表达，具有较低染色强度和较少凋亡细胞相对于UIRI，突出NAMPT激活的保护效应。然而，这种保护在UIRI/SBI+FK组无效，显示比单独UIRI/SBI更高caspase-3和NFκB表达，确认FK对抗SBI介导的抗炎和抗凋亡效应。

3.4. SBI在UIRI中恢复抗氧化防御、减少炎症和提升NAD??水平，而FK对抗其保护作用

UIRI显著损害氧化还原平衡，增加炎症介质和减少细胞能量池。具体地，UIRI显著降低抗氧化防御，如GSH、SOD、CAT和GPx活性减少所示，同时提升促炎细胞因子TNF-α和IL-6。平行地，UIRI提升损伤标记LDH和耗尽NAD??水平。SBI处理有效恢复抗氧化能力（增加GSH、SOD、CAT和GPx），抑制炎症（减少TNF-α和IL-6），降低细胞损伤（减少LDH）和提升NAD??水平与UIRI相比。相比之下，FK处理单独显示最小改善和在有些情况下加剧损伤标记（如进一步减少GSH和NAD??，和增加LDH）。当结合时，SBI和FK部分相互取消效应，UIRI/SBI+FK组显示减少抗氧化恢复、增加炎症细胞因子、提升LDH和减少NAD??与单独SBI处理相比。

3.5. SBI在UIRI中恢复肾功能和减少肾损伤标记，而FK对抗其保护效应

UIRI引起肾功能和损伤标记的深刻改变。首先，UIRI显著增加肾肥大指数（肾重量和肾体重比）同时减少尿输出和流速。SBI处理恢复两个参数，而FK显示无改善和部分对抗SBI效应在组合组。第二，UIRI损害肾过滤能力，如减少尿肌酐和肌酐清除率，和提升血清肌酐和BUN反映。SBI有效恢复这些指数向控制水平，而FK单独恶化或未能改善它们。SBI+FK组一致显示SBI保护效应的减弱。第三，UIRI提升损伤生物标记，包括血清胱抑素C、尿NGAL、和血清和尿KIM-1。SBI处理显著减少这些损伤标记，而FK进一步加剧或阻碍恢复，组合处理类似于UIRI水平。最后，UIRI disrupts 白蛋白 homeostasis，具有血清白蛋白减少和尿白蛋白、UAER和UACR增加。SBI处理改进所有这些措施，而FK再次对抗有益效应。

3.6. SBI在UIRI中恢复线粒体生物合成和能量代谢，而FK通过加剧线粒体功能障碍对抗其保护效应

Western印迹分析显示，与对照组相比，UIRI组显示显著较低水平的Nrf2、LKB1、TFAM、Nrf1、p-AMPK/t-AMPK、SIRT1和PGC-1α，指示UIRI后受损线粒体生物合成和能量代谢。FK施用（UIRI/FK）进一步减少p-AMPK/t-AMPK和SIRT1与UIRI组相比，建议NAMPT抑制加剧线粒体功能障碍。相反，SBI（UIRI/SBI）显著恢复Nrf2、LKB1、TFAM、Nrf1、p-AMPK/t-AMPK、SIRT1和PGC-1α与UIRI相比，证明NAMPT激活的保护效应。SBI和FK组合（UIRI/SBI+FK）导致显著减少TFAM、p-AMPK/t-AMPK、SIRT1和PGC-1α与UIRI/SBI相比，建议NAMPT抑制对抗SBI的保护效应。

3.7. 回归、中介和相关性分析识别NAD??作为线粒体生物合成和肾保护的中心调节剂

集成统计分析一致突出NAD??作为连接线粒体生物合成到肾保护的中心调节剂。回归分析证明较高NAD??水平与减少肾损伤显著相关，如与尿KIM-1反相关反映（β = -0.025, p < 0.001）。同时，NAD??显示强正相关与线粒体生物合成标记包括PGC-1α（β = 0.044, p < 0.001）、p-AMPK（β = 0.057, p < 0.001）、SIRT1（β = 0.053, p < 0.001）和Nrf1（β = 0.043, p < 0.001），强调其在促进线粒体适应中的作用。

中介分析进一步显示NAD??对KIM-1的效应由多个线粒体调节剂中介。Nrf1施加最强中介效应（-0.0186, p < 0.001），随后PGC-1α（-0.0086, p < 0.001）、SIRT1（-0.0076, p < 0.001）和LKB1（-0.0074, p < 0.001），而p-AMPK和Nrf2贡献较弱但仍显著效应。这些发现建议NAD??通过协调的转录和代谢调节剂网络抑制肾损伤，Nrf1和PGC-1α扮演特别突出角色。

相关性热图分析强化这些发现，显示NAD??与TFAM（0.94）、Nrf1（0.93）、PGC-1α（0.88）、SIRT1（0.88）和LKB1（0.88）强正关联，而尿KIM-1与NAD??（-0.94）、TFAM（-0.97）和Nrf1（-0.93）强反相关。这些一致趋势跨回归、中介和相关性分析突出NAD??作为肾保护中的关键枢纽，通过TFAM、Nrf1和PGC-1α行动驱动线粒体生物合成和减轻缺血再灌注损伤。

本研究通过多方面证据表明，SBI诱导的NAMPT激活通过增加NAD??生物合成、线粒体生物合成、减轻炎症信号和氧化应激防御，对IRI产生显著肾保护作用。相反，NAMPT抑制显示加剧IRI，从而证明NAMPT/NAD??在肾恢复中的重要性。这些发现强调了考虑NAMPT调节作为AKI到CKD挑战的新治疗方法的