功能性脂质体纳米药物RLNPP@Tha：通过CD44靶向和ROS响应机制增强脊髓损伤恢复的神经保护与抗炎新策略

　　本研究针对脊髓损伤(SCI)后严重的继发性损伤及神经功能缺损难题，开发了一种CD44靶向、ROS响应的脂质体纳米药物RLNPP@Tha，用于精准递送沙利度胺。该研究通过体外实验证实其可显著降低炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平50-70%，减少ROS约70%；在大鼠SCI模型中，RLNPP@Tha治疗组BBB评分提升至18-19分（对照组仅5-6分），并有效促进M1向M2小胶质细胞极化。该策略为解决沙利度胺系统毒性及生物利用度低的问题提供了新方案，为SCI临床治疗提供了重要参考。

　　

当脊髓遭受严重损伤时，不仅会造成直接的机械性损伤，更会引发一系列复杂的继发性病理级联反应，包括缺血、兴奋性毒性、氧化应激以及持续失调的神经炎症反应。这些反应共同导致组织严重受损、脱髓鞘以及胶质瘢痕形成，构成了神经轴突再生和功能恢复的巨大障碍。临床上，这表现为令人难以接受的功能丧失——超过80%的患者会遭遇不可逆的下肢瘫痪，仅有不到20%的患者能够获得有意义的恢复。目前，针对脊髓损伤的有效治疗方法十分有限，如何精准调控损伤局部的微环境，抑制有害的继发性损伤，是修复领域面临的一大挑战。

在这一病理过程中，被激活的小胶质细胞扮演了关键角色。这些小胶质细胞具有显著的可塑性，在损伤后可极化为不同的功能表型，其中促炎的M1表型会大量释放炎症细胞因子和活性氧(ROS)，加剧神经元凋亡和脱髓鞘，并抑制神经再生。因此，设法调控小胶质细胞的活化状态，促使它们从破坏性的M1表型向具有修复功能的M2表型转变，被认为是治疗脊髓损伤继发性损伤的核心策略之一。

沙利度胺作为一种免疫调节药物，因其能够抑制NF-κB信号通路并加速TNF-α mRNA的降解，展现出良好的抗炎潜力，理论上非常适合用于控制脊髓损伤后的神经炎症。然而，其严重的致畸性和周围神经病变风险极大地限制了其全身临床应用。若能将沙利度胺精准递送至脊髓损伤区域，实现局部高效作用并最大限度减少全身暴露，则有可能打破这一困境。

纳米技术药物递送系统为解决这一难题提供了新思路。通过设计具有特定靶向能力和响应性释放机制的纳米颗粒，有望克服生物屏障，实现药物的局部富集，并降低系统毒性。本研究成功开发了一种新型的CD44靶向且ROS响应的脂质体纳米药物，命名为RLNPP@Tha，旨在增强沙利度胺向损伤脊髓递送的选择性和有效性。CD44是一种 transmembrane 糖蛋白，在脊髓损伤等多种中枢神经系统损伤后的活化小胶质细胞和巨噬细胞上会显著上调和高表达，这为药物靶向递送提供了一个独特的分子靶点。同时，该设计在脂质体结构中加入了ROS响应元件。脊髓损伤部位的一个显著特征是ROS水平急剧升高，这可以作为一个独特的病理触发条件。这种ROS响应机制使得药物能够在损伤脊髓的氧化应激微环境中按需、局部释放，确保在需要的时间和地点达到较高的治疗浓度，同时最大限度地减少药物的提前释放和全身暴露。

研究人员假设，RLNPP@Tha能够特异性靶向CD44过表达的M1小胶质细胞，并通过其ROS响应机制在损伤部位精确释放沙利度胺。这种靶向和可控的递送有望减轻继发性炎症、调节小胶质细胞向促再生的M2表型极化、保护神经元免受氧化应激和凋亡，并在特定的脊髓损伤场景（如中度挫伤模型）中实现短期功能增益，为长期恢复创造条件。该研究旨在验证这种创新纳米药物系统选择性递送沙利度胺和调节炎症微环境的能力，为解决恢复行走能力等未满足的临床需求提供初步证据。

该研究发表于《European Journal of Pharmaceutical Sciences》，为了验证上述设想，研究团队综合运用了多种关键技术方法：采用薄膜水化法制备了载有沙利度胺的CD44靶向ROS响应脂质体(RLNPP@Tha)，并对其理化性质（粒径、Zeta电位、包封率等）进行了表征；通过体外释放实验考察了其在不同浓度H₂O₂条件下的ROS响应释药行为；利用流式细胞术和荧光显微镜评估了BV2小胶质细胞对纳米药物的摄取效率；通过ELISA试剂盒检测了炎症因子水平，并通过细胞毒性实验(CCK-8法)评估了其神经保护作用；研究使用雌性SD大鼠构建了T9椎板切除后挫伤型SCI模型，并随机分为假手术组、损伤+生理盐水组、损伤+游离沙利度胺组、损伤+非靶向脂质体组、损伤+无ROS响应性的靶向脂质体组以及损伤+RLNPP@Tha治疗组；通过Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分量表、斜板实验、网格行走测试等系统评估了实验动物后肢运动功能的恢复情况；在术后特定时间点收取脊髓组织，通过H&E染色、尼氏染色以及针对NeuN（神经元标志物）、GFAP（胶质纤维酸性蛋白，星形胶质细胞标志物）、IBA1（小胶质细胞/巨噬细胞标志物）、CD86（M1表型标志物）和CD206（M2表型标志物）的免疫组织化学/免疫荧光染色，综合评价了组织形态、神经元存活、胶质瘢痕形成以及小胶质细胞极化状态；通过血液生化分析和主要器官H&E染色评估了纳米药物的系统生物安全性。所有动物实验 procedures 均遵循ARRIVE指南，并获得天津医科大学动物护理和使用委员会的批准（批准号：IRB2024-DW-58）。

3.1. 脂质体表征及ROS响应释放验证

研究人员成功合成了RLNPP@Tha，其平均粒径为112.3 ± 4.7 nm，PDI为0.187 ± 0.012，Zeta电位为-18.5 ± 1.2 mV，包封率为79.2 ± 2.3%。体外释放研究表明，RLNPP@Tha在400 μM H₂O₂条件下12小时内药物释放率高达92.1 ± 2.5%，显著高于无H₂O₂条件（12.4 ± 1.8%）和200 μM H₂O₂条件（68.7 ± 3.2%），证实了其优异的ROS响应特性。

3.2. 体外靶向验证及ROS响应释放性能

细胞毒性实验表明RLNPP和RLNPP@Tha在测试浓度范围内对PC12细胞毒性很低，细胞活力均保持在90%以上。流式细胞术分析显示，经LPS/IFN-γ激活的BV2小胶质细胞对Cy5.5标记的RLNPP@Tha的摄取量（MFI > 8000 a.u.）显著高于未激活细胞（MFI ～2800 a.u.），约是后者的2.8倍，证实了其通过CD44介导的靶向作用。在抗炎和抗氧化方面，RLNPP@Tha能剂量依赖性地降低激活的BV2细胞内的ROS水平，在20 μg·mL?1浓度下其效果与抗坏血酸相当；同时，它还能显著抑制促炎细胞因子IL-1β（降低约70%）、IL-6（降低约60%）和TNF-α（降低约50%）的表达。在神经保护实验中，RLNPP@Tha（以沙利度胺计5 μg·mL?1）能将H₂O₂处理的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的存活率从约30%提高至约85%，效果优于游离沙利度胺（约42%）和空白脂质体，表明其具有增强的递送效率和可能的协同保护效应。

3.3. 体内靶向验证与小胶质细胞调控

免疫荧光染色显示，与假手术组相比，SCI+生理盐水组IBA1阳性（活化）的小胶质细胞数量显著增加，且细胞形态变为阿米巴样（炎症形态）。而RLNPP@Tha治疗减少了活化IBA1阳性小胶质细胞的数量。尽管研究未提供CD44与IBA1的直接共定位图像，但引用已有文献 strongly supports 了CD44在SCI后小胶质细胞/巨噬细胞上的表达上调，这为靶向策略提供了依据。

3.4. RLNPP@Tha介导的M1小胶质细胞极化调控

通过针对IBA1、CD86(M1)和CD206(M2)的双重免疫荧光染色发现，SCI+生理盐水组中主要是促炎的M1表型（IBA1+/CD86+）小胶质细胞，其相对细胞数量约占68%。RLNPP@Tha治疗则显著改变了小胶质细胞的极化状态，使M2表型（抗炎）小胶质细胞的相对细胞数量增加至约7%，同时M1表型减少至约3%，表明其能有效促进小胶质细胞从有害的M1表型向有益的M2表型转变。

3.5. 体内治疗效果比较：RLNPP@Tha vs LNPP@Tha

在运动功能恢复方面，RLNPP@Tha治疗组表现出最显著且持续的恢复效果，在损伤后28天时BBB评分达到18-19分，显著优于SCI+生理盐水组（5-6分）、SCI+游离沙利度胺组（8-9分）和SCI+LNPP@Tha组（12-13分）。组织病理学评估（H&E和尼氏染色）显示，RLNPP@Tha治疗组脊髓形态保存完好，病变体积减小，炎症细胞浸润减少，灰质区存活神经元数量更高。ELISA检测表明，RLNPP@Tha治疗在损伤后3天能更显著地降低脊髓组织中IL-1β（降低约60%）、IL-6（降低约50%）和TNF-α（降低约45%）的水平。免疫荧光结果进一步证实，RLNPP@Tha治疗组有更多的NeuN阳性神经元（约100–120个/视野 vs 盐水组约20个）和更低的GFAP阳性面积（约3–4% vs 盐水组15–18%），提示其具有神经保护和抑制反应性星形胶质增生的潜力。

3.6. 毒性及系统安全性评估

对小鼠的血液生化分析显示，即使以较高剂量（4 mg·kg?1）的RLNPP@Tha给药，其各项参数（红细胞、白细胞、血小板计数、血红蛋白、ALT、AST、肌酐、尿素）均在正常生理范围内，与对照组相当。主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色也未发现明显的组织损伤或炎症细胞浸润，细胞形态和组织结构正常完整，表明RLNPP@Tha具有良好的体内生物安全性和生物相容性。

综上所述，本研究开发的CD44靶向、ROS响应性脂质体纳米药物RLNPP@Tha，成功实现了沙利度胺向脊髓损伤炎症微环境的精准递送和可控释放。它通过高效靶向活化的小胶质细胞、显著降低氧化应激和炎症因子水平、促进小胶质细胞向M2抗炎表型极化、有效保护神经元和抑制胶质瘢痕形成等多重机制，最终显著促进了大鼠脊髓损伤后的运动功能恢复。该策略巧妙地利用了脊髓损伤区域的病理特征（CD44上调和ROS过高）作为靶向和触发释放的条件，不仅极大地提高了沙利度胺的治疗效果，还有效地规避了其系统毒副作用，展现了优异的生物安全性。

研究的讨论部分进一步阐释了其重要意义。首先，该靶向递送策略为解决沙利度胺的临床应用瓶颈提供了创新性解决方案。其次，RLNPP@Tha表现出的功能恢复程度（BBB评分18-19分）在类似的挫伤模型中达到了近乎完全恢复的水平，显著优于许多已报道的采用全身给药抗炎药或非靶向纳米载体的研究策略，凸显了其精准靶向递送的优势。再者，将CD44靶向与ROS响应释放相结合的双重策略，实现了时空可控的药物递送，比被动递送或单一刺激响应平台具有更高的精确度和安全性。当然，研究也存在一些局限性，例如缺乏对非ROS响应脂质体对照的长期毒性考察，以及对慢性期脊髓损伤和瘢痕成熟影响的长期观察等，这些都为未来的深入研究指明了方向。

总之，该研究不仅为脊髓损伤的治疗提供了一种极具前景的新型纳米药物候选，其基于病理微环境特征的智能递送设计理念也为其他神经炎症性疾病（如帕金森病、脑缺血、脑出血等）的药物研发提供了宝贵的借鉴和新的技术可能性。