黄精多糖通过TLR4/NF-κB/MAPK通路激活巨噬细胞并展现疫苗佐剂潜力

　　本研究首次揭示黄精多糖（PKP）通过TLR4/MyD88/TRIF信号轴激活NF-κB/MAPK通路，显著增强巨噬细胞免疫活性（TNF-α提升3.8倍）并促进抗原特异性抗体产生。其低毒性特性为替代传统佐剂（如LPS）提供了安全高效的植物源疫苗佐剂新选择。

　　

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◆ 材料与试剂

本研究所有试剂均来自知名供应商：杜尔贝科改良 Eagle 培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）购自Gibco（美国）；脂多糖（LPS）、MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和DAPI来自Sigma-Aldrich（美国）；TAK-242（瑞沙托维）购自MCE（美国）。Thermo Fisher Scientific（美国）提供小鼠TNF-α ELISA试剂盒和小鼠IL-6 ELISA试剂盒。抗体针对p65、p-p65、p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、MyD88、TRIF和GAPDH均购自CST（美国）。其他化学试剂均为分析纯。

◆ PKP的提取、纯化与化学成分

黄精多糖（PKP）从晒干的黄精中提取，得率为10.11%。成分分析显示PKP含有65.4%的总碳水化合物和6.5%的蛋白质。脱蛋白处理后，PKP的紫外光谱在280 nm和260 nm处未显示显著吸收峰，表明提取物中不含蛋白质和核酸（图1A）。

◆ PKP的FT-IR光谱分析及单糖组成

PKP的傅里叶变换红外光谱如图1B所示。3388 cm^-1处的宽谱带对应于O-H键的伸缩振动，2926 cm^-1处的吸收峰归因于C-H键的伸缩振动。1650 cm^-1处的吸收峰与结合水的H–O–H振动有关。1417 cm^-1处的峰归因于C–H的变角振动。1100–1010 cm^-1范围内的吸收峰是吡喃糖环的C–O–C和C–O–H键的伸缩振动的特征峰。这些特征表明PKP具有典型的多糖结构。通过离子色谱进一步分析单糖组成，结果显示PKP由甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和阿拉伯糖（Ara）组成，摩尔比为1.77:2.59:1.00:1.35:6.64:3.07:2.59（图1C）。

◆ 讨论

最早的中药药理专著《神农本草经》（公元前100年-公元200年）记载，黄精主要用于治疗中风、高热、筋伤、肉结及各种虚证[68]。《本草纲目》记载黄精属植物被称为“黄精”，因其蕴含“坤土”之精。《本草》记载黄精植物用于治疗五劳七伤、助筋骨、耐寒暑、益脾胃、润心肺。单服可延年益寿，填精髓。现代研究表明，黄精多糖（PKP）是黄精的主要活性成分，具有多种药理作用，包括免疫调节、抗肿瘤、抗病原体和调节肠道微生物群[30,31]。本研究首次阐明PKP通过TLR4/NF-κB/MAPK通路激活巨噬细胞，并证实其作为疫苗佐剂的潜力，为传统应用提供了分子机制验证，并定位其为一种有前景的低毒性候选物，用于改善疫苗介导的免疫力。

◆ 结论

在本研究中，我们研究了PKP对RAW264.7巨噬细胞活化的影响并阐明了其潜在机制（图11）。首先，PKP不仅能促进细胞增殖且无显著细胞毒性，还能增加RAW264.7细胞中TNF-α和一氧化氮（NO）的产生。因此，PKP显然对RAW264.7巨噬细胞具有激活作用。基于此观察，我们进一步研究了其分子机制，包括TLR4受体的参与以及下游NF-κB和MAPK信号通路的激活。结果表明，PKP通过TLR4/MyD88/TRIF轴激活NF-κB和MAPK通路。此外，体内研究表明，PKP显著增强了OVA免疫小鼠的抗原特异性免疫反应，表明其作为疫苗佐剂的潜力。总之，我们的研究为PKP的传统用途提供了科学依据，并表明PKP是一种有前途的疫苗佐剂候选物。